  實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ Real-Time qPCR）是分子生物學(xué)最常用的一種方法，它無疑是每個生物實(shí)驗(yàn)者的必備技能！然而對于大多初入實(shí)驗(yàn)的小白來說，qPCR真的一點(diǎn)都不Q，想要做出完美的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)需要過關(guān)斬將、披荊斬棘、克服重重困難！ Never mind！ 本帖跟隨小麥探索qPCR內(nèi)心世界！ 1 qPCR基本原理 在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。由于其操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)發(fā)展非常迅速。 視頻講解： qPCR介紹-Introduction to qPCR   專業(yè)英語Tips 模板 template ，序列 sequence 檢測 detect， 靈敏 sensitive 2 qPCR應(yīng)用 目前，qPCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥食品等行業(yè)，應(yīng)用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、藥物研究、腫瘤的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、動物疫病檢測等，還包括： ● 基因擴(kuò)增 ● 擴(kuò)增特異性分析 ● 基因定量分析 ● 基因檢測 ● 基因分型 ● SNP分析 ● RFLP多態(tài)性分析 ● 單/多基因表達(dá)研究 ● 高通量基因表達(dá)譜研究 …… 3 qPCR常用方法 染料法 熒光染料可與雙鏈DNA結(jié)合，每個循環(huán)的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。同時(shí)，其缺點(diǎn)也在于其非特異性。當(dāng)PCR反應(yīng)中有引物二聚體或者非特異性擴(kuò)增時(shí)，該染料也可以和這些非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，發(fā)出熒光，從而干擾對特異性產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量。 常用的染料為SYBR Green I，各公司針對熒光信號強(qiáng)度、抑制作用等進(jìn)行改進(jìn)，也推出了很多新的染料供大家選擇。 Promega采用新型熒光染料BRYT Green? Dye，對qPCR反應(yīng)沒有抑制作用，與雙鏈DNA結(jié)合后熒光信號更強(qiáng). 探針法 在PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對引物的同時(shí)加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5’端標(biāo)記一個報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。 下表對兩種方法進(jìn)行對比：
視頻講解： 染料法vs探針法-qPCR:Dye vs Probe 實(shí)驗(yàn)室小工具 專業(yè)英語Tips 溶解曲線 melt curve ， 變性 denature 報(bào)告分子reporter ，猝滅劑 quencher 4 qPCR一般步驟 提取RNA ——RT-PCR ——以cDNA為模板檢測 Real-Time qPCR MasterMix一般為預(yù)混液，只需要加入模板和引物就可以。在操作過程中，還需要根據(jù)所用Master Mix、模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個最佳反應(yīng)體系。 參比染料（reference dye）的作用是校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩(wěn)定的基線。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨(dú)分開。要根據(jù)不同公司的MasterMix進(jìn)行這一個步驟的選擇。 由于進(jìn)行qPCR前需要將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，因此可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇1步法（RT-PCR和qPCR在同一管中進(jìn)行）或2步法（RT-PCR和qPCR分開進(jìn)行）。 下表為大家總結(jié)了兩種方法如何選擇及優(yōu)勢：
視頻講解： 一步法vs兩步法-1step vs 2step 實(shí)驗(yàn)室小工具 GoTaq? Probe 1-Step RT-qPCR System GoTaq? Probe 2-Step RT-qPCR System 專業(yè)英語Tips 逆轉(zhuǎn)錄酶 reverse transcriptase 熱循環(huán) thermal cycling 5 qPCR常見參數(shù) 基線(baseline)：通常是3-15個循環(huán)的熒光信號 閾值(threshold)：自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍 Ct值：與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35 Rn(Normalized reporter)：熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。 △Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果  qPCR定量方法 絕對定量和相對定量的區(qū)別在于，絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。絕對定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 |
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