Hi，小伙伴們，本周繼續(xù)我們的RT之旅，在上期的內(nèi)容中我們介紹了RT-qPCR的第一步——反轉(zhuǎn)錄，講到怎樣獲得高質(zhì)量的cDNA模板，那么接下來就需要用我們獲得的模板去做定量PCR，在此之前大家要了解什么是定量PCR，定量PCR的原理是什么，只有知道了這些，我們才能較為順利的去定量。所以，本期我們將為大家著重介紹RT-qPCR中定量的原理，希望對大家有所幫助。

我們先來回顧一下常規(guī)PCR和熒光定量PCR的區(qū)別，常規(guī)PCR是對PCR的最終產(chǎn)物進(jìn)行定性和半定量分析，最終只能通過跑膠看出結(jié)果；熒光定量PCR則是根據(jù)熒光信號(hào)的變化，實(shí)時(shí)檢測每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，從而達(dá)到對初始模板量的定性和定量分析。

那么熒光定量PCR是怎樣進(jìn)行的呢？下面我們將按照三方面的原理來逐步解析其工作原理：

一、熒光定量PCR儀的系統(tǒng)原理

在定量PCR儀中主要包含三大系統(tǒng)，PCR熱循環(huán)系統(tǒng)、光路系統(tǒng)以及熒光檢測系統(tǒng)。儀器在工作過程中，由PCR熱循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行目標(biāo)序列的擴(kuò)增，由光路系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物的熒光物質(zhì)進(jìn)行激發(fā)，最后由檢測系統(tǒng)對激發(fā)的熒光進(jìn)行檢測統(tǒng)計(jì)，最后得到每個(gè)循環(huán)中產(chǎn)物的擴(kuò)增量，將其轉(zhuǎn)化為成為擴(kuò)增曲線，用于之后的定性或定量研究。    

二、熒光定量PCR工作的化學(xué)原理

目前最常用的熒光定量PCR方式主要有兩種，一是染料法，另一個(gè)是探針法。

1、染料法

以SYBR Green I 染料為例， SYBRGreen I 是一種DNA雙鏈小溝結(jié)合染料，游離時(shí)發(fā)光極微弱，結(jié)合DNA后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。每形成一條雙鏈，就有相應(yīng)數(shù)目的SYBRGreen I 嵌入，并產(chǎn)生熒光信號(hào)，熒光的強(qiáng)度與體系中雙鏈的濃度成正比，從而保證了熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步，熒光的強(qiáng)度就代表了體系中雙鏈產(chǎn)物的濃度。其大致的工作流程如下圖：

此種方法當(dāng)然也會(huì)有它的優(yōu)缺點(diǎn)，優(yōu)點(diǎn)是成本低， SYBRGreen I 試劑價(jià)格低，適合初步篩查目標(biāo)基因；缺點(diǎn)是無特異性，針對所有雙鏈形式DNA均有熒光基團(tuán)嵌入，給出所有雙鏈DNA的總熒光信號(hào)，不能進(jìn)行多重篩查，每個(gè)PCR管中只能檢測一個(gè)目標(biāo)基因。

2、探針法

以TaqMan 探針為例，TaqMan 探針是一段寡核苷酸單鏈，與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，探針兩端分別有一個(gè)報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，不會(huì)檢測到熒光，PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq DNA聚合酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，報(bào)告基團(tuán)釋放并發(fā)出熒光。每合成一條DNA鏈，就會(huì)切斷一條探針，并產(chǎn)生一個(gè)單位熒光信號(hào)，信號(hào)的強(qiáng)度與結(jié)合到DNA鏈上的探針成正比。

那么自然的探針法也會(huì)有它的優(yōu)缺點(diǎn)，優(yōu)點(diǎn)是特異性高，探針為目標(biāo)基因特異性結(jié)合序列，增加檢測特異性，可進(jìn)行多重基因篩查，同一體系，多個(gè)基因同時(shí)篩查，不同基因?qū)?yīng)不同探針，不同探針對應(yīng)不同熒光標(biāo)記；缺點(diǎn)是成本高，探針合成的價(jià)格較高，多重基因篩查需保證不同探針含不同熒光標(biāo)記，不能互相干擾。

三、熒光定量PCR工作的數(shù)學(xué)原理

由于熒光定量PCR最后我們得到的數(shù)據(jù)就是Ct值，所以在了解其數(shù)學(xué)原理前，我們有必要先了解一下熒光定量PCR的幾個(gè)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。根據(jù)擴(kuò)增曲線趨勢，整個(gè)擴(kuò)增過程大致分為四個(gè)時(shí)期：基線期、指數(shù)增長期、線性增長其及平臺(tái)期。

（1）基線：擴(kuò)增曲線的水平部分，是熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)前的背景熒光值，是測量偶然偏差產(chǎn)生，一般機(jī)器默認(rèn)值為3-15，需根據(jù)具體情況做調(diào)整；

（2）指數(shù)增長期：在PCR初期，PCR反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物量與初始模板量符合這種指數(shù)關(guān)系的時(shí)期；

（3）線性增長期：隨著反應(yīng)不斷進(jìn)行，產(chǎn)物對PCR反應(yīng)的抑制、taq酶的消耗的因素的影響，退火不僅僅發(fā)生在模板與引物之間，導(dǎo)致PCR反應(yīng)的效率不斷降低，PCR產(chǎn)物量與初始模板量不再呈現(xiàn)指數(shù)關(guān)系，PCR反應(yīng)逐漸進(jìn)入線性期；

（4）平臺(tái)期：PCR產(chǎn)物不再隨著循環(huán)數(shù)的增加而增加。

 前面我們提到熒光定量PCR最后我們得到的數(shù)據(jù)就是Ct值，那么何為Ct值？如何用Ct值計(jì)算初始模板量？Ct值是指從基線到指數(shù)增長期的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。用數(shù)學(xué)公式來體現(xiàn)PCR整個(gè)過程如下圖：

現(xiàn)實(shí)的PCR擴(kuò)增中受擴(kuò)增酶以及引物等的影響，是存在擴(kuò)增效率的，因此產(chǎn)物的分子數(shù)并不能按照理想公式來計(jì)算。帶入擴(kuò)增效率，然后公式兩邊取對數(shù)，那么當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)是Ct時(shí)，公式變?yōu)?/span>lgN₀ =［-lg(1+e)］×Ct + lgN_Ct，模板起始分子數(shù)的對數(shù)與循環(huán)數(shù)（Ct值）呈線性關(guān)系，Ct值越大，模板起始分子數(shù)約少，這就是Ct值用來定量的數(shù)學(xué)原理。