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在學(xué)習(xí)過(guò)程中，我們經(jīng)常會(huì)遇到各種PCR字眼，什么qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR，好多同學(xué)看的頭暈眼花也沒(méi)弄明白這幾種PCR有什么區(qū)別，那你呢？你了解PCR這個(gè)大家族嗎？還在傻傻分不清嗎？PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡(jiǎn)稱，是一種體外擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，在生物科學(xué)領(lǐng)域、分子診斷領(lǐng)域、親子鑒定、法醫(yī)鑒定以及犯罪調(diào)查等方面發(fā)揮了巨大作用，是迄今為止最為重要的技術(shù)之一。經(jīng)過(guò)演化和革新，PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了三代：普通PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）以及數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)。圖1 PCR儀器的發(fā)展歷程（Lee NY., 2018）PCR的基本原理與DNA的體內(nèi)復(fù)制相類似，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火和延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)高溫（95℃左右）加熱一定時(shí)間后，使其解離成單鏈，以便它與引物結(jié)合；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：將溫度降至55℃左右時(shí)，引物與模板DNA單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合；③引物的延伸：再將溫度調(diào)至72℃左右（DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度），DNA模板和引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，沿著磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。這樣經(jīng)變性、退火和延伸重復(fù)若干個(gè)循環(huán)后，就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。圖2 PCR的基本反應(yīng)步驟（圖片源自：Wikipedia）普通PCR即一代PCR，使用普通PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增靶基因，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）實(shí)時(shí)熒光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光基團(tuán)，在整個(gè)PCR過(guò)程中通過(guò)收集熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每一個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量分析。qPCR常用的有兩種方法：SYBR Green法和TaqMan探針?lè)ā?/span>①熒光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中最常用的熒光染料，它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合。在PCR反應(yīng)體系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就會(huì)在過(guò)程中與雙鏈DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此，反應(yīng)中發(fā)出的全部熒光信號(hào)就會(huì)與反應(yīng)中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強(qiáng)度也會(huì)隨著產(chǎn)物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結(jié)合，因此可能產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格相對(duì)較低；使用方便；對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇，通用性好；檢測(cè)靈敏度高。缺點(diǎn)：可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，需要通過(guò)熔解曲線分析識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴(kuò)增；不適合進(jìn)行多重qPCR檢測(cè)。②熒光探針?lè)ǎ═aqMan技術(shù)）：TaqMan探針是最早用于定量的方法，也是臨床檢測(cè)中最常用的檢測(cè)方法。PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針是一個(gè)寡核苷酸，5'端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（Reporter, R），3'端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（Quencher, Q）。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，以至于無(wú)法檢測(cè)到熒光信號(hào)；而當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段），探針會(huì)被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射底的熒光不會(huì)再被吸收，從而可以在熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA，就形成一個(gè)熒光分子，PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成完全同步，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號(hào)累積的越多，熒光強(qiáng)度越大。優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)特異性強(qiáng)；靈敏度高；適合進(jìn)行多重qPCR檢測(cè)；PCR后續(xù)無(wú)需處理，節(jié)省時(shí)間和原料成本。缺點(diǎn)：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針；探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性，定量時(shí)容易受試劑和酶性能影響；淬滅難以徹底，本底較高；檢測(cè)結(jié)果很難判斷實(shí)際的擴(kuò)增特性。圖3 熒光染料法和熒光探針?lè)ǖ墓ぷ髟恚–ao et al., 2020）注：多重PCR，也稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)。3.數(shù)字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）數(shù)字PCR即三代PCR，是對(duì)原始PCR的另一種改進(jìn)，是一種能夠?qū)崿F(xiàn)核酸絕對(duì)定量的精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)，基于泊松分布原理將核酸樣品分配到大量獨(dú)立、平行的微反應(yīng)單元（納升級(jí)）中，使每個(gè)反應(yīng)室中平均只有一個(gè)拷貝或者沒(méi)有目標(biāo)DNA分子，然后加入熒光信號(hào)進(jìn)行擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)核酸分子的絕對(duì)計(jì)數(shù)，提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。4. 逆轉(zhuǎn)錄PCR（ Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR）逆轉(zhuǎn)錄PCR也叫反轉(zhuǎn)錄PCR，將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合，是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將一條單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無(wú)論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無(wú)RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術(shù)靈敏且應(yīng)用廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過(guò)一步法或兩步法進(jìn)行，一步法是RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一試管中進(jìn)行；而在兩步法中兩個(gè)反應(yīng)是分開依次進(jìn)行的。5.實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆轉(zhuǎn)錄）的意思，所以RT-qPCR就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄PCR，即以mRNA或總RNA為模板，先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)行定量檢測(cè)分析。因?yàn)镽T-PCR只可以定性，但不能進(jìn)行定量分析。與RT-PCR一樣，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴(kuò)增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進(jìn)行，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進(jìn)行。圖4 RT-qPCR的一步法和兩步法（Soler et al., 2020）1.PCR，通常指的是普通PCR，以雙鏈DNA為模板，以dNTP為底物，定性擴(kuò)增雙鏈DNA。2.qPCR和Real-time PCR，指的是實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以cDNA為模板，以dNTP 為底物，對(duì)擴(kuò)增出的DNA進(jìn)行定量分析。3.RT-PCR，指的是逆轉(zhuǎn)錄PCR，以由mRNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，以dNTP 為底物，進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，屬于PCR的變種，結(jié)果只能定性，不能定量。4.RT-qPCR，指的是實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，是qPCR+RT-PCR的組合，將總RNA或mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后再作為模板，以dNTP為底物，進(jìn)行qPCR的定量分析。表1 不同PCR方法的主要優(yōu)缺點(diǎn)Cao Y, Yu M, Dong G, et al. Digital PCR as an Emerging Tool for Monitoring of Microbial Biodegradation. Molecules. 2020,25(3).Lee NY. A review on microscale polymerase chain reaction based methods in molecular diagnosis, and future prospects for the fabrication of fully integrated portable biomedical devices. Mikrochim Acta. 2018,185(6).Soler M, Scholtz A, Zeto R, et al. Engineering photonics solutions for COVID-19. APL Photonics. 2020,5(9). 本文來(lái)源信諾金達(dá)，版權(quán)歸原作者所有，授權(quán)轉(zhuǎn)載請(qǐng)聯(lián)系原作者。文章只為學(xué)術(shù)新聞信息的傳播，不代表本公眾號(hào)觀點(diǎn)。如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系刪除。
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