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1.
RT-PCR，qPCR，Real-time PCR，RT-qPCR區(qū)分 RT-PCR指的是逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription PCR），在RT-PCR中，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板通過PCR進行DNA擴增；qPCR和Real-time
PCR均指實時熒光定量PCR（Quantitative
Real-Time PCR），相較于常規(guī)PCR，qPCR能夠在每個循環(huán)周期內(nèi)對擴增產(chǎn)物進行實時定量，從而對起始模板數(shù)量進行精確的分析，具有高敏感度和特異性；RT-qPCR指的是實時逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription- quantitative PCR），是qPCR RT-PCR的組合，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再作為模板進行qPCR定量分析。2. SYBR
Green I染料法 SYBR Green I染料：一種可以在PCR循環(huán)過程中隨著PCR產(chǎn)物的累計而對其進行檢測的高度特異性雙鏈DNA結(jié)合染料；原理：通過SYBR Green I染料與PCR過程中產(chǎn)生的雙鏈DNA結(jié)合，而對PCR產(chǎn)物進行實時檢測；過程：（1）在PCR過程中，DNA聚合酶可對目標(biāo)序列進行擴增，產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，即“擴增子”；（2）SYBR
Green I染料與每一個新產(chǎn)生的雙鏈DNA分子進行結(jié)合；（3）隨著PCR的進擴增，越來越多的擴增子生成，由于SYBR Green I染料可與所有的雙鏈DNA結(jié)合，因此熒光強度也會隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加；（如下圖所示）優(yōu)點：對DNA模板沒有選擇性，可用于監(jiān)測任何雙鏈DNA序列的擴增，運行成本低；缺點：SYBR Green I染料可能與非特異性的雙鏈DNA序列發(fā)生結(jié)合，產(chǎn)生假陽性信號。除此之外，需要不斷的優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴增。
圖片源自：https://www./faq-real-time-pcr 3. Taqman探針法 原理：通過熒光探針在PCR循環(huán)過程中隨PCR產(chǎn)物的累積而對其進行檢測。 過程：（如上圖所示） (1) 構(gòu)建Oligo探針：5’端標(biāo)記熒光染料報告基團（Reporter, R），3’端標(biāo)記淬滅基團(Quencher, Q)。當(dāng)探針保持完整時，淬滅基團的靠近會通過空間上的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）而顯著降低報告基團發(fā)射的熒光； (2) 如果存在目標(biāo)序列，探針便會在其中一個引物結(jié)合位點的下游發(fā)生退火，并隨著引物的延伸通過Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性，完成切除； (3) 探針的切除將報告染料基團和淬滅染料基團進行分離，增強了報告染料基團的信號。并且可以將探針從目的鏈上去除，使引物繼續(xù)沿模板鏈末端延伸； (4) 每經(jīng)過一個循環(huán)，就會有更多的報告基因染料分子從各自的探針上切斷，熒光強度會隨著合成的擴增片段數(shù)量的增加而增加； 優(yōu)點：（相較于SYBR Green I染料法） (1) 高特異性和靈敏性：熒光探針只與目的序列結(jié)合，不受非特異性產(chǎn)物的影響； (2) 兼容多重反應(yīng)：由于不同波長的熒光報告基團可以標(biāo)記不同的探針，因此可以選擇不同的報告基因染料標(biāo)記探針，在一個反應(yīng)管內(nèi)同時擴增并檢測不同的序列； (3) 節(jié)省時間和原料成本：無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本； 缺點：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針。 4. 絕對定量（Absolute Quantification） 原理：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行的定量。 舉例：可以通過qPCR計算出待測樣本的初始拷貝數(shù)，如1ml血液里有多少個HBV病毒?？筛鶕?jù)病毒的拷貝數(shù)，監(jiān)控疾病狀態(tài)。 5. 相對定量（Relative Quantification） 原理：用于分析特定樣品相對于參照樣品某個基因表達量的變化。 舉例：用于檢測藥物引起的基因表達改變，將經(jīng)藥物處理樣品的特定目標(biāo)基因的表達水平相對未處理樣品的基因表達水平進行比較。 7. 擴增曲線（Amplification Plot）PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過程中實時熒光信號為縱坐標(biāo)制作的曲線。（如下圖所示）擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。PCR起始時，熒光信號還未發(fā)生變化的幾個循環(huán)。即樣本的熒光背景值，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋。一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，可通過算法去除。熒光域值設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期，缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，通常儀器會自動設(shè)置。如果手動設(shè)置，原則要大于樣本的熒光背景值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段。11.循環(huán)閾值（Cycle
Threshold, Ct值）Ct值是指在熒光 PCR 擴增過程中，當(dāng)擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。Ct值與模板的拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，經(jīng)過的循環(huán)數(shù)就越少，Ct 值也就越小。用作熒光信號標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)部參照，可以逐孔校正因移液不準(zhǔn)確、孔位置及熒光波動造成的變動。通常，不同儀器有不同ROX需求，目前國產(chǎn)儀器基本無需ROX校準(zhǔn)要求。熒光染料報告基團（Reporter, R）釋放的熒光強度除以惰性參比染料的熒光強度。在特定PCR條件設(shè)置下所產(chǎn)生的信號量級。ΔRn=(Rn )
– (Rn-)，Rn : 一次反應(yīng)的Rn值，Rn-：未反應(yīng)樣品的Rn值。
qPCR擴增完成后，對PCR產(chǎn)物加熱，隨溫度升高，DNA逐漸解鏈，導(dǎo)致熒光強度下降，當(dāng)?shù)竭_某一溫度時（Tm），會導(dǎo)致大量的產(chǎn)物解鏈，熒光急劇下降。熔解曲線分析可以用來確定不同的反應(yīng)產(chǎn)物，對PCR的特異性進行鑒定。（如下左圖所示）DNA雙鏈解鏈一半的溫度稱為熔解溫度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。G-C含量越高，Tm值越高，成正比關(guān)系。17.對數(shù)曲線（logarithm
curve）對熔解曲線取對數(shù)，形成峰圖，更直觀的顯示PCR產(chǎn)物片段的情況。通常根據(jù)引物設(shè)計原則，擴增產(chǎn)物長度在80-300 bp范圍內(nèi)，熔解溫度在80℃-90℃之間。（如下右圖）18.標(biāo)準(zhǔn)品（Standards）用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的已知濃度樣品，為保證標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定，通常將基因片段克隆到質(zhì)粒后，作為標(biāo)準(zhǔn)品。19.標(biāo)準(zhǔn)曲線（Standard
Curve）將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進行梯度稀釋（通常為5-6個稀釋梯度），將未知樣品和梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品在同一qPCR實驗中進行反應(yīng)。根據(jù)擴增曲線，以稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為橫坐標(biāo)，起始拷貝數(shù)的log值為縱坐標(biāo)構(gòu)建。（如下圖所示）理論上，稀釋樣品的擴增曲線之間有均勻的間距，如果產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距（兩個樣本Ct值差）符合等式“2n＝稀釋倍數(shù)”，如：10倍稀釋的樣本，2n＝10，n=3.32，即Ct值差為3.32。20.擴增效率（Amplification
efficiency）擴增效率與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相關(guān)，斜率的絕對值與熒光曲線間距相同，擴增效率計算式為E＝10-1/斜率，如果將擴增效率用百分率來表示，則E%=(E-1)×100%。一般說來，擴增效率接近 100%是重復(fù)性好的標(biāo)志，然而在實際操作時，擴增效率應(yīng)該在90%-105%之間，如果擴增效率低，可能的原因是引物設(shè)計不當(dāng)，或者反應(yīng)條件未優(yōu)化；若擴增效率大于100%，可能由于稀釋樣品加樣錯誤，或者有非特異性產(chǎn)物擴增，如引物二聚體產(chǎn)生。 
21.內(nèi)參（Internal
reference）在同一反應(yīng)中作為靶序列擴增，并用不同的探針進行雙重PCR檢測的對照序列。22.內(nèi)參基因（Reference
gene）內(nèi)源性參比基因的表達水平在樣品間不存在差異，如管家基因（Housekeeping
genes, HKGs），常用GAPDH、β-actin 、18SrRNA和28S rRNA等。23.標(biāo)準(zhǔn)樣品（Standard
Sample）相對定量中使用的參比樣品，用與其他樣品進行比較，確定某一基因的相對表達水平。24.陽性對照（Positive
Control）用已知量模板作對照，通常用來檢查引物工作是否正常，以及反應(yīng)程序是否正確設(shè)置。25.陰性對照（Negative
Control）重要的陰性對照包括無模板對照（No template control，NTC）和無反轉(zhuǎn)錄酶對照（No reverse transcriptase
control，NRC）。NTC：包含除模板之外的所有擴增反應(yīng)所必要組分的對照反應(yīng)，模板通常用水代替，用于檢測試劑污染或外源DNA造成的污染；NRC：在反轉(zhuǎn)錄的時候多配制一個體系，不加反轉(zhuǎn)錄酶，其余成分正常添加，在相同的反轉(zhuǎn)錄過程下獲得的產(chǎn)物，以此為模板，觀察擴增情況，用于檢驗cDNA中是否有基因組DNA的污染。
百力格探針引物合成 百力格生物致力于提供高質(zhì)量工業(yè)級探針引物合成服務(wù)，可以實現(xiàn)單批次2 OD-8000 OD大規(guī)格的高純度、高精度、防污染探針與引物的合成與純化，充分滿足客戶對于穩(wěn)定性、可靠性的需求。 qPCR探針類型 類型
| 詳情
| | 單標(biāo)熒光探針 | FAM、VIC、HEX、TET、ROX、JOE、Cy3、CY5、TAMRA、Texas Red等 | | 雙標(biāo)熒光探針 | 熒光基團：FAM、VIC、HEX、ROX、Cy3、Cy5、NED等 淬滅基團：MGB、BHQ、TAMARA系列等 | | 特殊單標(biāo)熒光探針 | 地高辛Dig、磷酸Phosphorylation、生物素Biotin等 | | 修飾 | 硫代修飾、氨基修飾、巰基修飾、稀有堿基等 |
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參考文獻： [1]https://www./cn/zh/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/essentials-real-time-pcr.html； [2] https://zhuanlan.zhihu.com/p/388534929 [3]
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