【原】多基因同時(shí)表達(dá)時(shí)，選IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)）還是2A肽（自我剪切肽）？

智者不學(xué)生物 2024-02-04 發(fā)布于上海

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很多實(shí)驗(yàn)都需要同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因，具體方法包括兩種或多種質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染、使用多個(gè)或雙向啟動(dòng)子，或者構(gòu)建雙順反子或多順反子載體。多順反子載體可以同時(shí)表達(dá)來自同一個(gè)mRNA的兩種或多種獨(dú)立的蛋白質(zhì)。目前，雙順反子載體或者多順反子載體主要采用2種策略，如下圖所示：

策略（1）用IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)）來同時(shí)表達(dá)基因1和基因2，如下圖所示。

關(guān)于IRES的詳細(xì)內(nèi)容可以瀏覽往期文章：

內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）的原理、方法和應(yīng)用

策略（2）用2A肽（自我剪切肽）來同時(shí)表達(dá)基因1和基因2，如下圖所示。

關(guān)于2A肽的詳細(xì)內(nèi)容可以瀏覽往期文章：

什么是2A肽？2A肽在蛋白串聯(lián)表達(dá)、病毒學(xué)和疫苗研究中的應(yīng)用

IRES和2A肽介導(dǎo)的多基因表達(dá)模式圖（圖片來源于addgene blog）

為什么要選擇多基因串聯(lián)表達(dá)（多順反子載體）？

很多時(shí)候我們并不是直接檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)，而是開發(fā)了新的方法來將目的基因和報(bào)告基因（如熒光基因或抗性基因或熒光素酶基因等）同時(shí)表達(dá)。利用這些報(bào)告基因能夠輕松篩選或選擇高水平表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞。多順反子質(zhì)?？梢源_保任何表達(dá)標(biāo)記基因的陽(yáng)性細(xì)胞也應(yīng)該表達(dá)目的基因，因?yàn)樗鼈兌紒碜韵嗤霓D(zhuǎn)錄本翻譯而來。

盡管可以通過使用具有多個(gè)單獨(dú)表達(dá)盒的質(zhì)粒來驅(qū)動(dòng)多個(gè)基因的共表達(dá)，但從同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本中表達(dá)基因有時(shí)是有利的，特別是當(dāng)只有一部分質(zhì)粒被包裝用于病毒遞送時(shí)，或者兩個(gè)或多個(gè)基因之間的相對(duì)表達(dá)水平很重要。

多順反子載體表達(dá)多個(gè)基因的原理：

科學(xué)家們?cè)趩喂烧淩NA病毒中發(fā)現(xiàn)了一些規(guī)律，從而能夠從單個(gè)轉(zhuǎn)錄本中有效地翻譯多個(gè)基因。

（1）IRES元件（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)）原理

真核生物的翻譯通常從5'帽子開始，因此每個(gè)mRNA只翻譯一次。然而，一些雙順反子載體利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）元件來讓單個(gè)mRNA 可以從多個(gè)位點(diǎn)開始翻譯。IRES驅(qū)動(dòng)的翻譯起始可以不依賴于mRNA的5’末端的帽子結(jié)構(gòu)。

圖片來源于addgene blog

在上圖中，可以看到 IRES 元件充當(dāng)另一個(gè)核糖體募集位點(diǎn)，從而導(dǎo)致來自單個(gè)mRNA的兩種蛋白質(zhì)的共表達(dá)。

IRES最初是在脊髓灰質(zhì)炎病毒RNA中發(fā)現(xiàn)的，能夠促進(jìn)真核細(xì)胞中病毒基因組的翻譯。從那時(shí)起，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了各種IRES序列，大部分IRES來自于病毒，但也有一些來自細(xì)胞的mRNA。

IRES元件非常有用，常見于雙順反子載體中。但是，它們確實(shí)有一些缺點(diǎn)。這些元件非常大（500-600 bp），可能會(huì)在包裝能力有限的病毒轉(zhuǎn)移載體中占用寶貴的空間。此外，使用 IRES 元件一次表達(dá)兩個(gè)以上的基因可能會(huì)失敗。有大量研究發(fā)現(xiàn)，IRES下游基因的表達(dá)量通常低于IRES上游基因的表達(dá)量。

（2）2A肽（自我剪切肽）原理

為了克服IRES元件的一些缺點(diǎn)，科學(xué)家們將“自裂解”2A肽改編到多順反子載體中。這些肽最初也是在小核糖核酸病毒中發(fā)現(xiàn)，2A肽長(zhǎng)度很短（約20個(gè)氨基酸），并且從相同的mRNA中產(chǎn)生的多個(gè)基因的表達(dá)量是一樣的?！白粤呀狻笨赡懿⒉煌耆珳?zhǔn)確，因?yàn)?A肽被認(rèn)為通過使核糖體跳過2A元件C 末端肽鍵的合成來發(fā)揮作用，導(dǎo)致2A序列末端與下游下一個(gè)肽之間的分離。“裂解”發(fā)生在2A肽末端的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）殘基之間，這意味著上游順反子將在末端添加一些額外的殘基，而下游順子將從脯氨酸開始。

如果大家想將目的基因與熒光蛋白或其他報(bào)告基因共表達(dá)，最簡(jiǎn)單的方法是從已經(jīng)克隆了多順反子元件和報(bào)告基因的質(zhì)粒上替換目的基因。另外，還可以將2A肽和報(bào)告基因作為一個(gè)整體從質(zhì)粒上PCR下來，然后插入到目的基因的表達(dá)載體上去。

IRES和2A肽該選哪個(gè)？

（1）當(dāng)要求2個(gè)基因表達(dá)量相同時(shí)，采用2A肽。因?yàn)镮RES上游基因的表達(dá)量通常高于IRES下游基因的表達(dá)量。

（2）由于2A肽的裂解發(fā)生在其C末端的GP之間，因此2A肽會(huì)和protein 1融合，可能會(huì)影響protein 1的定位和功能（如下圖所示）。并且2A肽在GP之間裂解會(huì)導(dǎo)致P氨基酸（脯氨酸）位于protein 2的起始位置，也可能對(duì)protein 2的定位和功能產(chǎn)生影響。此時(shí)建議使用IRES元件。