隨著基因工程的發(fā)展，重組治療性蛋白的需求也大幅增加^[1,2]。作為一種重要重組蛋白，治療性mAbs具有特異性和低免疫原性。近幾年來(lái)，重組mAbs已經(jīng)成為包括癌癥及免疫系統(tǒng)缺陷在內(nèi)的許多疾病治療的主導(dǎo)藥物^[3,4]。至今為止，F(xiàn)DA（美國(guó)食品藥品管理局）和EMA（歐洲藥品管理局）已經(jīng)批準(zhǔn)超過(guò)70種治療性mAbs，其中39種是由CHO細(xì)胞生產(chǎn)（見(jiàn)表1），除此之外，還有幾百種mAbs處于臨床階段^[5]。

重組mAbs，或稱基因改造抗體通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在多種宿主細(xì)胞表達(dá)。免疫球蛋白GmAbs（IgGmAbs）包括兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈。重組mAbs需要折疊、組裝及合適地糖基化才具有生物學(xué)活性^[6]。不同宿主細(xì)胞產(chǎn)生的治療性mAbs顯示不同的免疫原性和治療效果，暗示宿主細(xì)胞影響重組mAbs的生物學(xué)功能^[4]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是一種簡(jiǎn)單的系統(tǒng)，其轉(zhuǎn)錄后修飾比較少而且不常見(jiàn)，導(dǎo)致這種系統(tǒng)只適合表達(dá)抗體片段或者是單鏈抗體^[7,8]。昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)錄后修飾和人細(xì)胞不同，導(dǎo)致重組mAbs和人天然mAbs有很大差異^[9]。對(duì)比其他系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的治療性重組蛋白具有正確的轉(zhuǎn)錄后修飾，相似的分子結(jié)構(gòu)和糖基化，和人體內(nèi)抗體相接近^[10]。因此，除了一些抗體片段，目前市場(chǎng)上的大多數(shù)治療性mAbs使用哺乳細(xì)胞生產(chǎn)^[11-13]，并且更傾向于使用CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)載體是CHO細(xì)胞表達(dá)不同重組蛋白的關(guān)鍵因素，并且決定了mAbs的產(chǎn)量和質(zhì)量^[14]。本篇文章，詳述了使用CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)mAbs的表達(dá)載體構(gòu)建最新進(jìn)展。

治療性重組mAbs需要合適的糖基化和其他翻譯后修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)其生物功能，因此，大多數(shù)治療性重組mAbs使用哺乳細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)，CHO系統(tǒng)最常被用作表達(dá)系統(tǒng)^[15]。對(duì)比其他的表達(dá)系統(tǒng)，CHO細(xì)胞具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）更適合懸浮培養(yǎng)，更符合工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需求^[16]，（2）生產(chǎn)的mAbs更貼近天然mAbs的結(jié)構(gòu)和功能，（3）在這些細(xì)胞中人源病毒不能感染和擴(kuò)增^[17]，（4）外源基因可以穩(wěn)定地整合到CHO細(xì)胞中，（5）分泌低量的內(nèi)源蛋白，有利于目的重組mAbs的分離純化^[10]。當(dāng)在CHO細(xì)胞中表達(dá)治療性重組mAbs，HC和LC基因需要同時(shí)翻譯，這點(diǎn)連同細(xì)胞系的成功轉(zhuǎn)染都是CHO細(xì)胞生產(chǎn)mAbs時(shí)面臨的重大挑戰(zhàn)。

單順?lè)醋虞d體

最近幾年，CHO細(xì)胞表達(dá)mAbs的表達(dá)載體的不同構(gòu)建策略已經(jīng)建立（表2）。早期的研究集中在使用獨(dú)立的載體和表達(dá)輕鏈或者重鏈序列（圖1a）^[18,19]。但是，這種策略耗時(shí)且困難，準(zhǔn)備和高效共轉(zhuǎn)兩個(gè)載體是個(gè)挑戰(zhàn)，不僅如此，使用兩種篩選標(biāo)記降低了獲得穩(wěn)定細(xì)胞克隆的效率^[20,21]，另外，這種低效地將兩種篩選標(biāo)記及目的基因整合進(jìn)細(xì)胞基因組DNA影響輕重鏈基因的表達(dá)。相較而言，瞬時(shí)表達(dá)使得在哺乳細(xì)胞中分析蛋白表達(dá)更高效^[22]。單順?lè)醋虞d體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用于早期抗體分子的篩選，但是其表達(dá)量較雙啟動(dòng)子及雙順?lè)醋虞d體的表達(dá)量要低^[5]。這種可能歸因于這種單順?lè)醋虞d體系統(tǒng)每個(gè)多肽鏈?zhǔn)怯筛髯元?dú)立的啟動(dòng)子介導(dǎo)，輕鏈由于分子量較重鏈低在轉(zhuǎn)錄和翻譯上效率更高^[23,24]。單順?lè)醋酉到y(tǒng)的這些不足不僅增加了工作量，而且不適合大規(guī)模mAbs生產(chǎn)^[25,26]。因此構(gòu)建多順?lè)醋淤|(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)輕重鏈及篩選基因在同一個(gè)載體上是非常有必要的。

多啟動(dòng)子表達(dá)載體

一個(gè)多啟動(dòng)子的mAb的表達(dá)載體具備不同啟動(dòng)子來(lái)分別介導(dǎo)輕重鏈基因的轉(zhuǎn)錄（圖1b）。目前，CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用的啟動(dòng)子主要來(lái)源于猿猴空泡病毒40（SV40）、延伸因子-1α（EF-1α）和巨細(xì)胞病毒（CMV）。當(dāng)然EF-1α是最強(qiáng)啟動(dòng)子^[27]（表2）。Bayat等構(gòu)建了使用CMV啟動(dòng)子的單順?lè)醋虞d體、雙載體和雙順?lè)醋?，用其表達(dá)重組的mAbs，發(fā)現(xiàn)使用雙啟動(dòng)子表達(dá)的蛋白產(chǎn)量最高^[5]。但是因?yàn)樵谝粋€(gè)多啟動(dòng)子的載體上每個(gè)啟動(dòng)子負(fù)責(zé)一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，這可能導(dǎo)致基因表達(dá)水平的不均衡^[28]。以mAbs為例，這將導(dǎo)致輕重鏈的表達(dá)水平不一致，從而造成兩個(gè)啟動(dòng)子間的相互干擾或抑制。另外，在許多情況下，多啟動(dòng)子載體的能力有限，很難適合兩個(gè)以上的轉(zhuǎn)錄盒。因此這種方法的適用有限。

三順?lè)醋虞d體

三順?lè)醋虞d體在一條mRNA上表達(dá)輕重鏈及篩選標(biāo)記基因，允許三種基因同時(shí)表達(dá)，并且將上述使用傳統(tǒng)載體的表達(dá)問(wèn)題降低到最低。三順?lè)醋虞d體的輕重鏈表達(dá)水平相同，這使得mAb的表達(dá)水平提高、聚集率低和糖基化一致。兩種三順?lè)醋虞d體，一種利用IRES，另一種利用Furin-2A。

圖1：?jiǎn)慰寺】贵w表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

A：?jiǎn)雾樂(lè)醋虞d體，B：多啟動(dòng)子載體表達(dá)系統(tǒng)，C：IRES介導(dǎo)的載體，D：Furin-2A介導(dǎo)的載體。GOI：插入基因，PolyA：聚腺苷酸化信號(hào)，IRES：核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)，F(xiàn)2A：Furin-2A。

IRES介導(dǎo)的載體

IRES是一段幾百堿基的非編碼序列，定位于一些病毒基因組中，通常在RNA病毒的5’非編碼端。IRES可以介導(dǎo)一種不依賴5’帽子結(jié)構(gòu)的翻譯起始，可以促使單一mRNA轉(zhuǎn)錄本上多種基因的表達(dá)^[28]。在翻譯過(guò)程中，IRES元件促進(jìn)非依賴帽子結(jié)構(gòu)的起始和IRES元件下游基因的翻譯^[29]。在這種策略中，IRES元件插入在輕重鏈閱讀框的中間，整個(gè)序列包含重鏈、IRES和輕鏈在內(nèi)都由一個(gè)啟動(dòng)子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄（圖1c）。在翻譯階段，第一個(gè)開(kāi)放閱讀框由帽子結(jié)構(gòu)機(jī)制介導(dǎo)翻譯，在IRES下游的第二個(gè)閱讀框則一種不依賴帽子結(jié)構(gòu)的機(jī)制進(jìn)行^[28,30,31]，因此，達(dá)到了一個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)完整重組蛋白的設(shè)想。

IRES的使用克服了單順?lè)醋虞d體和多啟動(dòng)子表達(dá)載體出現(xiàn)的不同啟動(dòng)子中間相互干預(yù)的問(wèn)題^[32]。單順?lè)醋虞d體系統(tǒng)中目的蛋白和篩選標(biāo)記基因處于不同啟動(dòng)子控制下，造成得到表達(dá)全部基因的克隆的概率很低^[33,34]。本系統(tǒng)中，篩選基因同樣使用IRES元件連接，因此輕重鏈及篩選基因可以在同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)，從而增加陽(yáng)性克隆的概率^[18,28]。另外，三順?lè)醋右惨蛟撓到y(tǒng)輕重鏈表達(dá)水平一致而降低了mAbs的產(chǎn)量^[28]。例如，抗腫瘤壞死因子α的mAbs，由CHO細(xì)胞IRES介導(dǎo)的三順?lè)醋酉到y(tǒng)表達(dá)，抗體的產(chǎn)量要比雙質(zhì)粒系統(tǒng)顯著性提高^[35]。但是，Hennecke等發(fā)現(xiàn)非帽子結(jié)構(gòu)依賴的翻譯效率要比帽子結(jié)構(gòu)依賴型效率低^[36]，因此，盡管所有基因處于同一條轉(zhuǎn)錄的mRNA，它們的翻譯水平也存在差異。因此，目的基因排序設(shè)計(jì)對(duì)于構(gòu)建mAb的表達(dá)載體尤為重要^[37]。

Furin-2A介導(dǎo)的載體

2A多肽一種自剪切多肽，首次發(fā)現(xiàn)于核糖核酸病毒，主要包括四類，分別來(lái)源于手足口病毒（F2A）、馬鼻病毒（E2A）、1型豬腸病毒（P2A）和昆蟲(chóng)病毒（T2A）。這種2A序列遠(yuǎn)小于IRES，只有約20個(gè)氨基酸。輕重鏈間插入2A序列，通過(guò)在2A序列的C端最后兩個(gè)氨基酸GP間共轉(zhuǎn)錄剪切，產(chǎn)生獨(dú)立的輕重鏈，增加了共表達(dá)蛋白的產(chǎn)量（圖1d）^[37,38]。2A介導(dǎo)的自剪切機(jī)制會(huì)在核糖體上跳過(guò)2A序列C端甘氨酰-脯氨酰的形成^[39,40]。

之前的研究表明在2A序列前添加Furin序列可以在剪切后除去多余的氨基酸^[41,42]。Furin-2A介導(dǎo)的載體表達(dá)mAbs表達(dá)量要比IRES介導(dǎo)的載體高，不管其瞬轉(zhuǎn)還是穩(wěn)轉(zhuǎn)^[18,42]。另外，F(xiàn)2A序列的上游基因翻譯效率要比下游高^[18]，因此重鏈輕鏈在F2A序列兩側(cè)的安排影響mAb的產(chǎn)量。高的輕鏈表達(dá)量發(fā)現(xiàn)與高細(xì)胞活率、高mAb產(chǎn)量和低聚集相關(guān)^[23]。構(gòu)建多順?lè)醋虞d體時(shí)組合2A和IRES序列會(huì)提高效率^[30]，但是仍存在很多挑戰(zhàn)，首先，F(xiàn)urin-2A自剪切不完全（85-95%），這會(huì)降低效率。另外，2A多肽的C端可能影響蛋白的功能和定位^[26]。

多種應(yīng)用于重組mAbs表達(dá)載體的構(gòu)建策略已經(jīng)建立，一系列的載體已經(jīng)產(chǎn)生，例如單順?lè)醋虞d體、多啟動(dòng)子載體以及IRES或Fruin-2A介導(dǎo)的三順?lè)醋虞d體。這些載體都有自身的優(yōu)缺點(diǎn)。其中，F(xiàn)urin-2A介導(dǎo)的載體呈現(xiàn)出最有效的表達(dá)載體，突出優(yōu)勢(shì)是具有高自剪切效率和相等量的輕重鏈表達(dá)量。在未來(lái)，我們認(rèn)為未來(lái)的研究需要集中在使用順式元件增加重組mAb的表達(dá)。另外，提高Furin-2A介導(dǎo)的載體的自剪切能力也將是保證輕重鏈蛋白的準(zhǔn)確且相同表達(dá)量的優(yōu)勢(shì)。

參考文獻(xiàn)：

Li YM, Tian ZW, Xu DH, Wang XY, Wang TY.Construction strategies for developing expression vectors for recombinant monoclonal antibodyproduction in CHO cells.Mol Biol Rep. 2018 Dec;45(6):2907-2912. 

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