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1 載體必需元件   Minimal Plasmid Made by Synbio Center: pSC0331A 目前幾乎所有的商業(yè)化質(zhì)粒載體的克隆系統(tǒng)都是E.coli（大腸桿菌），因?yàn)樵谪S富培養(yǎng)基中E.coli生長非常快，20 min內(nèi)就可以復(fù)制一代，所以我們通常是在E.coli中完成載體系統(tǒng)的構(gòu)建和質(zhì)粒制備，而在目標(biāo)菌株或其他類型細(xì)胞中完成所需基因的表達(dá)和其他基因操作，也正因?yàn)檫@個(gè)原因，幾乎所有的商業(yè)化質(zhì)粒載體都有一套E.coli的復(fù)制起始位點(diǎn)和篩選元件。 非常值得一提的是，在人類基因組測(cè)序計(jì)劃的時(shí)代所開發(fā)出來的BAC（細(xì)菌人工染色體）系統(tǒng)載體，在構(gòu)建長片段DNA和小規(guī)模基因組時(shí)有著巨大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠鋯慰截愄卣魇沟觅|(zhì)粒的復(fù)制對(duì)細(xì)胞的代謝系統(tǒng)產(chǎn)生的影響是最小的，所以在構(gòu)建很多對(duì)細(xì)胞有毒性的基因和基因組時(shí)會(huì)取得成功，而常規(guī)的高拷貝載體很多時(shí)候會(huì)無法得到正確構(gòu)建（往往會(huì)得到有很多突變或者缺失的構(gòu)建），甚至是使得克隆宿主菌無法正常生長出單克隆菌落。 常用的篩選標(biāo)記有抗性篩選、ccdB和SacB負(fù)篩選、營養(yǎng)缺陷型篩選等等，部分列表如下：    Registryof Standard Biological Parts   pET家族載體的RBS序列是固定的，如上圖箭頭所示   針對(duì)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄單元的序列設(shè)計(jì)，需要考慮到Kozak序列的添加，這樣基因的翻譯水平可能會(huì)得到適當(dāng)增強(qiáng)。脊椎動(dòng)物細(xì)胞中的Kozak序列一般是GCCACC。 IRES + the second CDS 真核細(xì)胞一般不支持多順反子結(jié)構(gòu)的基因設(shè)計(jì)，但是在病毒基因組序列中發(fā)現(xiàn)的IRES序列可以有特例，如上圖中所示的那樣，在第一個(gè)CDS的終止密碼子后面加上IRES序列，那么便可以直接在IRES序列的末端加上第二個(gè)CDS進(jìn)行基因表達(dá)，這樣就可以實(shí)現(xiàn)同一條真核細(xì)胞mRNA可翻譯出兩個(gè)不用蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)。 |
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