在生物醫(yī)學研究中，有時需要使用單個質(zhì)粒在細胞或生物體中同時表達多個基因，為此，已經(jīng)采用了幾種策略:

1. 多個啟動子融合到基因的開放閱讀框架(ORFs);

2. 基因間剪接信號的插入；由單一啟動子驅(qū)動表達的基因融合；

3. 基因間蛋白裂解位點的插入；

4. 基因間內(nèi)核糖體進入位點(IRESs)的插入。

這里重點介紹下IRES,因為IRES的使用很廣泛，原因主要有以下幾點：基因在IRES前后的共同表達； IRES后添加亞細胞定位序列的可行性； 含有IRES的商業(yè)表達質(zhì)粒的可用性。然而，IRES有兩個主要的局限性，首先就是因為IRES 通常都會大于500bp ，這可能會讓構(gòu)建病毒的質(zhì)粒變大，降低了病毒的滴度；其次就是位于IRES后的基因的翻譯效率遠低于位于IRES前的基因。因此自剪切多肽2A就應運而生，能夠克服以上兩個弊端。

自剪切多肽2A的命名及作用機制：自剪切多肽2A是源于口蹄疫病毒，2A多肽的平均長度為18-22個氨基酸。"2A"這個名稱是指小核糖核酸病毒多蛋白的一個特定區(qū)域，是由研究人員采用的系統(tǒng)命名法產(chǎn)生的。如下圖：

有4種2A Peptide目前研究的比較多，我們也對這4個效率做個總結(jié)。這是4中2A Peptide，包括P2A,T2A,E2A,F2A,前面的GSG 是為了提高切割效率加的序列。

作者先是構(gòu)建了幾個質(zhì)粒，將各個2A Peptide構(gòu)建到GFP 和mCherry 兩種熒光蛋白中間，后期可以用免疫熒光來進行觀察。

先是在HEK293細胞中研究切割效率，從B 圖可以直觀的看到P2A 的切割效率最高，計算的方式就是 切割效率=切割的/(切割的+未切割的) ，我們來看A圖，actin 為內(nèi)參，C 是對照。接著看下α-GFP ，切割的條帶越明顯說明切割效率越好，當然前提是表達的質(zhì)粒量是一樣的。B 圖就是對A 圖的定量分析。C圖的免疫熒光也是同樣的道理，因為發(fā)生了切割，綠色與紅色就是兩個不同的蛋白，不會發(fā)生重合，綠色越亮，效率越好。這些都說明了P2A 的切割效率最好。