1.避免污染

為避免RNase/DNase等污染，可以在操作前仔細(xì)清潔實(shí)驗(yàn)平臺(tái)、試劑盒、器皿和工具等，并使用經(jīng)RNase/DNase清洗的試劑和器皿。此外，應(yīng)該盡可能快地進(jìn)行樣品提取，以減少RNA/DNA降解和污染的可能性。

2.明確目的和選擇合適的方法

RNA和DNA在分子結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性上有所不同，并且不同的樣本類型也有不同的組織結(jié)構(gòu)和特征，因此需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆颖绢愋瓦x擇合適的RNA/DNA提取方法。例如，在提取RNA時(shí)，需要更加注意RNase的污染問題；而在提取DNA時(shí)，則需要更加注意DNA的不斷降解問題。

3.優(yōu)化樣品破碎步驟

樣品破碎對(duì)RNA/DNA提取至關(guān)重要。不同樣品類型需要不同的破碎方法，如高壓均質(zhì)機(jī)、超聲波等。在破碎過程中，需要注意破碎時(shí)間和功率控制，以避免過度破碎導(dǎo)致RNA/DNA的降解。

細(xì)胞破碎方法：超聲波法、高壓均質(zhì)法、玻璃珠法等都是常用的細(xì)胞破碎方法。

4.RNA/DNA的純化和濃縮

在提取和純化RNA/DNA過程中，需要去除可能存在的污染物，如蛋白質(zhì)、鹽等，并盡可能地減少DNA和RNA的降解。此外，在進(jìn)行RNA/DNA濃縮時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的方法，如酚/氯仿法或柱層析法等。

5.對(duì)提取的RNA/DNA進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估

在提取RNA/DNA之后，需要對(duì)其進(jìn)行確定性和質(zhì)量評(píng)估。可以使用分光光度計(jì)和凝膠電泳等技術(shù)來測(cè)定RNA/DNA的濃度和質(zhì)量，并評(píng)估是否存在RNase/DNase污染等問題。

6.RNase/DNase污染：

RNase或DNase的污染很容易導(dǎo)致RNA/DNA降解，因此需要使用經(jīng)RNase/DNase清洗的器皿和試劑，并在操作中避免污染。

7.溫度控制：

RNA/DNA在高溫下易于分解，因此在提取RNA/DNA時(shí)要控制好溫度。在冷凍樣品之前，通常建議在低溫環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞或收集組織，以最大程度地保護(hù)RNA/DNA。

8.RNA/DNA保存：

RNA/DNA應(yīng)該儲(chǔ)存在-80℃冰箱中，以避免降解和污染。在長(zhǎng)期儲(chǔ)存之前，建議進(jìn)行濃縮，并將RNA/DNA用RNase-free水稀釋至合適的濃度。

9.質(zhì)檢：

在提取RNA/DNA之后，需要對(duì)其進(jìn)行確定性和質(zhì)量評(píng)估?？梢允褂梅止夤舛扔?jì)來測(cè)定RNA/DNA的濃度和質(zhì)量，或者使用凝膠電泳來確認(rèn)RNA/DNA的大小和純度.

1.RNA/DNA濃度低：

如果提取得到的RNA/DNA濃度較低，則可以通過濃縮RNA/DNA溶液或在提取過程中增加樣品量來提高RNA/DNA的濃度。

2.RNA/DNA質(zhì)量不佳：

如果RNA/DNA分離后質(zhì)量不佳，則可能是由于RNase/DNase污染、過度破碎、過度處理等原因?qū)е碌?。需要仔?xì)檢查每個(gè)步驟，并采取相應(yīng)的措施來避免這些問題。

3.提取RNA或DNA有選擇性：

有時(shí)，RNA或DNA的提取會(huì)出現(xiàn)選擇性問題，即只能提取其中一種。這通常是由于使用的試劑或條件不適合同時(shí)提取RNA和DNA所導(dǎo)致的?？梢試L試更換試劑或優(yōu)化條件，以獲得更好的RNA/DNA提取結(jié)果。

4.樣品殘留：

在提取RNA/DNA時(shí)，倒掉廢液后可能會(huì)有樣品殘留在管子或器皿中。這可能會(huì)導(dǎo)致RNA/DNA的污染和降解，因此需要特別小心地清潔所有器皿和工具，確保沒有任何殘留物。

總之，在進(jìn)行RNA/DNA提取時(shí)需要注意許多方面，并且可能會(huì)遇到一些問題。如果出現(xiàn)問題，需要仔細(xì)檢查每個(gè)步驟并逐步解決問題，以確保最終得到高質(zhì)量的RNA/DNA樣本。

1.動(dòng)物組織DNA提取準(zhǔn)備

① 材料：動(dòng)物組織

② 試劑：TIANGEN血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，無水乙醇等

③ 設(shè)備：離心機(jī)，微量移液器等

2.動(dòng)物組織DNA提取步驟

① 處理材料：取動(dòng)物組織10mg，盡量切碎，加200μl緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。

② 加入20μl蛋白酶K溶液，混勻后56℃水浴，直至組織溶解（不同組織裂解時(shí)間不同，通常需1-3小時(shí)即可完成）。簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠，再進(jìn)行下一步驟。

③ 加入200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠。（溶解DNA）

注意：加入緩沖液GB時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般70℃放置時(shí)會(huì)消失，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如溶液未變清亮，說明細(xì)胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少和提取出的DNA不純。

④ 加入200μl無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。（沉淀DNA）

⑤ 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12,000rpm（～13,400×g）離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。（吸附沉淀）

⑥ 向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm（～13,400×g）離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。

⑦ 向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm（～13,400×g）離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。

⑧ 向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm（～13,400×g）離心30s，倒掉廢液。（6、7、8為漂洗）

⑨ 將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm（～13,400×g）離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。（注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的PCR等實(shí)驗(yàn)）

⑩ 將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12,000rpm（～13,400×g）離心2min，將溶液收集到離心管中。（溶解洗脫DNA）（注意：采用硅基質(zhì)膜吸附的DNA，可將DNA在低鹽高pH值條件下洗脫下來。pH值在7.0-8.5之間洗脫效率較高，pH值低于7.0則洗脫效率很低）

洗脫緩沖液體積不應(yīng)該少于50μl，體積過小影響回收效率。為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min，12,000rpm（～13,400×g）離心2min。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防止DNA降解。

1.植物組織DNA提取儀器與設(shè)計(jì)準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)儀器：高速離心機(jī)；烘箱；冰箱；水浴鍋；高壓滅菌鍋；Nanodrop。

實(shí)驗(yàn)試劑：玻璃珠，十二烷基磺酸鈉(SDS)；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸

（EDTA）；氯化鈉；苯酚；氯仿；無水乙醇等。

2.植物組織DNA提取步驟

植物組織的DNA提取通常采用機(jī)械研磨的方法破碎植物的組織和細(xì)胞，由于植物細(xì)胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對(duì)DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強(qiáng)還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。

詳細(xì)操作步驟如下：

① SDS提取緩沖液在65℃水浴中預(yù)熱。

② 將葉片置于1.5ml離心管中，液氮速凍，組織研磨器打樣。

③ 加入700ml的SDS提取緩沖液，渦旋搖勻。

④ 置于65℃的水浴中，每隔10min輕輕搖動(dòng)，30min后取出。

⑤ 加入200mlKAc溶液，搖勻，放入-20℃冰箱30min。

⑥ 10000rpm離心5min，上清移至新離心管中，12000rpm離心5min。

⑦ 上清移至新離心管中，加入700ml異丙醇，-20℃冰箱30min。

⑧ 10000rpm離心5min，棄上清，加入500ml70%乙醇漂洗。

⑨ 棄液體，晾干。

⑩ DNA純度與濃度測(cè)定（使用nanodrop）。

DNA純度：DNA的OD260/OD280一般為1.8左右。

OD260/OD280?1.8：說明較純；

OD260/OD280>1.8：說明可能有RNA污染；

OD260/OD280<1.8：說明可能有蛋白質(zhì)污染。

3.植物組織DNA提取注意

① 葉片磨得越細(xì)越好。

② 注意移液器的正確使用。

③ 由于植物細(xì)胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應(yīng)迅速，以免組織解凍，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。

4.RNA提取注意事項(xiàng)

① 組織樣本要盡可能的新鮮，避免反復(fù)凍融。

② 提取時(shí)組織要充分研磨，組織量不宜過少，更不宜過多。

③ 加入裂解液后應(yīng)給予充分的孵育時(shí)間，使樣本充分裂解。

④ 在用Trizol法提取時(shí)，分層后吸取上清的原則是“寧愿少吸，不能多吸”，千萬不能提取到中間層，否則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的基因組DNA污染。

⑤ 洗滌時(shí)洗滌液應(yīng)充分浸潤(rùn)到管壁的四周，確保洗滌徹底。

⑥ 柱式提取法，洗滌完后除了對(duì)柱子進(jìn)行空離后，還應(yīng)當(dāng)將吸附柱置于超凈臺(tái)內(nèi)吹風(fēng)5~10 min，使有機(jī)溶劑充分揮發(fā)干。

⑦ 柱式法最后洗脫時(shí)候，當(dāng)加入DEPC水后還應(yīng)孵育3~5 min，或者提前將DEPC水加熱至60℃，可提高洗脫得率。傳統(tǒng)的Trizol裂解異丙醇沉淀法最后RNA是用DEPC水溶解沉淀，則應(yīng)當(dāng)給予適當(dāng)溶解時(shí)間，并用槍頭不斷吹吸離心管底部。

1.獲得RNA效率低有一下原因

① 樣品裂解或勻漿處理不徹底

② 最后得到地RNA沉淀未完全溶解

2.A260/A280＜1.65原因

① 檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品不是溶于TE，而是溶于水。低離子濃度和低PH條件下，A280值會(huì)較高

② 樣品勻漿時(shí)加地試劑量太少

③ 勻漿后樣品未在室溫放置2分鐘

④ 水相中混有有機(jī)相

⑤ 最后得到地RNA沉淀未完全溶解

3.RNA降解原因

① 組織取出后沒有馬上處理或冷凍

② 樣品或提取地RNA沉淀保存于-5--20度，未在-60--70度保存

③ 細(xì)胞在胰酶處理時(shí)被破壞

④ 溶液或離心管未經(jīng)RBase去處理

4.預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾個(gè)方面

① 經(jīng)常更換新手套。因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有細(xì)菌，可能導(dǎo)致RNase污染。

② 使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

③  RNA在Trizol試劑中不會(huì)被RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

④ 配制溶液應(yīng)使用無RNase的水（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至中濃度0.1%(v/v)，放置過夜，高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。