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微生物DNA、RNA和蛋白質(zhì)共提取方法

A Method for Co-extraction of Microbial DNA, RNA, and Protein

劉思佳¹，趙圣國^{1, *}

¹動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京

*通訊作者郵箱：zhaoshengguo@caas.cn

摘要：基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析對研究微生物群落結(jié)構(gòu)組成與變化、功能特征及其與宿主表型關(guān)聯(lián)等具有重要意義。多組學(xué)分析有必要對樣本DNA、RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行共提取，用于后續(xù)測序或質(zhì)譜測定，這將大大減少試驗樣品誤差和減少珍貴樣品用量。本文利用TRIZOL試劑可以將DNA、RNA和蛋白質(zhì)分層的原理，同時提取微生物的這三種生物大分子物質(zhì)，具有簡便快捷、引入誤差少的優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞: 微生物，DNA，RNA，蛋白質(zhì)，共提取

材料與試劑

1.50 ml離心管 (D/RNase-Free)  (TIANGEN，catalog number: CT-002-50-01)

2.15 ml離心管 (D/RNase-Free)  (TIANGEN，catalog number: CT-002-15-01)

3.1.5 ml離心管 (D/RNase-Free)  (TIANGEN，catalog number: HC117-02)

4.TRIZOL (Invitrogen，catalog number: 15596018)

5.三氯甲烷 (Dr. Ehrenstorfe，catalog number: L17739500ME)

6.異丙醇 (國藥，catalog number: 8010921801)

7.無水乙醇 (國藥，catalog number: 1000925901)

8.DNase I (TaKaRa，catalog number: 2212)

9.RNase Inhibitor (Takara，catalog number: 2313A)

10.DEPC H₂O (Invitrogen，catalog number: 750024)

11.10× PCR buffer (Sigma-Aldrich，catalog number: 11699121001)

12.dNTP mixture (10 mM) (Takara，catalog number: 4019)

13.Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen，catalog number: 10966018)

14.檸檬酸鈉 (Sigma-Aldrich，catalog number: 71402-250G)

15.NaOH (Sigma-Aldrich，catalog number: S5881-1kg)

16.鹽酸胍 (生工，catalog number: A510243-0100)

17.SDS (Macklin，catalog number: S817788-100g)

18.超純水 (D/RNase-free) (BI，catalog number: 01-866-1B)

19.RNA純化試劑盒 (TIANGEN，catalog number: DP412)

20.Bradford蛋白定量試劑盒 (Bestbio，catalog number: BB-3411)

儀器設(shè)備

1.全自動冷凍研磨儀 (德國RETSCH，catalog number: Cryomill)

2.生物分析儀 (Agilent Technologies，catalog number: 2100)

3.渦旋震蕩儀 (Scientific Industries，catalog number: vortex-genie2T)

4.離心機 (SIGMA，catalog number: 3-18k)

5.水浴鍋 (TIANDZ，catalog number: DZKW-S-6)

6.NanoDrop^TM光譜儀 (Thermo Scientific，catalog number: 2000)

7.Qubit熒光定量儀 (Invitrogen，catalog number: 2.0)

8.電泳儀 (Bio-Rad，catalog number: CHEF Mapper)

9.PCR儀 (Thermofisher，catalog number: Veriti 96-Well Thermal Cycler)

實驗步驟

一、樣品前處理

1.采集微生物樣品，置于液氮保存。

2.取約5 ml（或5 g）液氮凍存的微生物樣品，置于研磨罐 (50 ml) 中，加入1顆20 mm和10顆5 mm鋼珠，利用全自動冷凍研磨儀在振動頻率為30 Hz條件下研磨5 min，研磨完成后取出置于50 ml 離心管。

3.加入5 ml TRIZOL溶液充分混勻，室溫放置5 min。

4.加入0.2倍體積的三氯甲烷溶液，渦旋混勻15 s，放置3 min后離心 (12,000 × g，4 °C，15 min)。離心后分為三層，上層為RNA，中層為蛋白質(zhì)，下層為DNA。

二、總RNA提取^[1,2,3]

1.取上層水相RNA到新的50 ml離心管 (RNase-Free) 中,加入等體積預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min，或-20 °C放置1 h，離心 (12,000 × g，4 °C，15 min)。

2.棄上清，添加與異丙醇等量的預(yù)冷75%乙醇，使用移液槍輕輕將整塊沉淀吹起懸浮，離心 (7,500 × g，4 °C，10 min)，棄乙醇溶液。

3.在室溫放置5-10 min，直至干燥。

4.加入100 μl超純水 (RNase-free)，水浴 (55-60 °C) 10-15 min，促進(jìn)RNA溶解。

5.利用RNA純化試劑盒純化，去除無機離子等雜質(zhì)，按說明書操作。

6.DNase I (RNase-free) 消化去除RNA溶液中gDNA，反應(yīng)體系為20 μl RNA溶液，5 μl 10× DNase I Buffer，2 μl DNase I，0.5 μl RNase Inhibitor，22.5 μl DEPC H₂O。37 ℃孵育25 min。

7.利用RNA純化試劑盒純化，去除DNase I以及gDNA消化物，得到純凈的RNA溶液。

8.利用細(xì)菌通用引物27F 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 檢測RNA溶液中是否有gDNA殘留。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包括：2.5 μl 10x PCR buffer，0.5 μl dNTP mixture, 1 μl 27F引物(10 μM)，1 μl 1492R引物 (10 μM)，0.25 μl Platinum Taq DNA polymerase, 1 μl RNA溶液，18.75 μl 超純水；反應(yīng)程序為：首先94 °C 5 min，隨后94 °C 30 s，54°C 30 s，72 °C 1 min 30 s 35個循環(huán)，最后72 °C 10 min 。利用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

9.使用生物分析儀檢測RNA濃度和完整性。

10.RNA樣品置于-80 °C保存。

三、總DNA提取

1.取中間層和下層溶液，加入0.3倍TRIZOL體積的無水乙醇，顛倒混勻，室溫靜置3 min，離心 (2,000 × g，5 min)。將上清液保存到新的50 ml離心管中 (用于蛋白質(zhì)的分離)。

2.在沉淀中加入與TRIZOL等體積的0.1 M的檸檬酸鈉溶液，室溫靜置30 min, 離心 (2,000 × g，4 °C，5 min)，棄上清。重復(fù)該步驟一次。

3.室溫放置10 min，干燥DNA。

4.加入50-100 μl 8 mM NaOH溶液，混勻重懸DNA。

5.利用NanoDrop^TM光譜儀、Qubit熒光定量儀對DNA質(zhì)量和濃度檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA完整性進(jìn)行檢測。

6.DNA樣品置于-20 °C或-80 °C保存。

四、總蛋白質(zhì)提取^[4]

1.取步驟三 (1) 中的上清液，加入1.5倍TRIZOL體積的異丙醇，室溫靜置10 min，離心 (12,000 × g，4 °C，10 min)。

2.棄上清，加入2倍TRIZOL體積的0.3 M鹽酸胍溶液，室溫靜置20 min，離心 (7,500 × g，4 °C，10 min)，棄上清。此步驟重復(fù)3次。

3.加入2倍TRIZOL體積的無水乙醇，渦旋混勻，室溫靜置20 min，離心 (7,500 × g，4 °C，10 min)，棄上清。

4.室溫干燥10 min,重懸于1% SDS溶液，50 °C孵育10 min。

5.利用Bradford蛋白定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。

6.蛋白質(zhì)樣品置于-20 °C或-80 °C保存。

溶液配方

1.0.1 M 檸檬酸鈉溶液：25.807 g 檸檬酸鈉，用10%乙醇溶液定容至1000 ml。

2.10%乙醇溶液：10 ml 無水乙醇，用超純水定容至100 ml。

3.0.8 mM NaOH溶液：0.032 g NaOH，用超純水定容至1000 ml。

4.0.3 M鹽酸胍溶液：28.659 g 鹽酸胍，用95%乙醇定容至1000 ml。

5.95%乙醇溶液：95 ml 無水乙醇，用超純水定容至100 ml。

6.1% SDS溶液：1 g SDS，用超純水定容至100 ml。

7.75%乙醇溶液：75 ml 無水乙醇，用超純水定容至100 ml。

致謝

感謝中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程支持

參考文獻(xiàn)

1.Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987). Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162: 156-159.

2.Liu, S., Zheng, N., Zhao, S. G. and Wang, J. Q. (2020). Exploring the diversity of active ureolytic bacteria in the rumen by comparison of cDNA and gDNA. Animals 10: 2162.

3.劉思佳，趙圣國，鄭楠，王加啟. (2020). 瘤胃微生物RNA 提取中樣品前處理方法的優(yōu)化. 微生物學(xué)雜志 40(1): 88-93.

4.Hummon, A. B., Lim S. R., Difilippantonio, M. J. and Ried, T. (2007). Isolation and solubilization of proteins after TRIzol? extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques 42: 467-472.