理化學(xué)研究所(理研)生命醫(yī)科學(xué)研究中心基因組免疫生物學(xué)理研白眉研究小組組長尼古拉斯·帕里什理研白眉研究小組組長、小島將平基礎(chǔ)科學(xué)特別研究員等共同研究小組發(fā)現(xiàn)，“轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性[1]”是皮膚病變等的遺傳風(fēng)險。

本研究成果聚焦于至今為止被忽視的基因組多態(tài)性——轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性，可以期待為進行適合每個患者診斷、預(yù)防、治療的“基因組醫(yī)療”的發(fā)展做出貢獻。 在調(diào)查疾病遺傳風(fēng)險的基因組寬相關(guān)分析( GWAS ) [2]中，一般使用單核苷酸多態(tài)性[2]，由于技術(shù)問題，轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性迄今為止還沒有被使用。 這次，共同研究小組開發(fā)了從人類基因組數(shù)據(jù)中正確鑒定轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性的軟件，實施了利用轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性的GWAS。 通過生物銀行日本( BBJ ) [3]收集的約18萬人中42種疾病的GWAS結(jié)果顯示，五種轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性與三種疾病(瘢痕疙瘩、2型糖尿病、前列腺癌)密切相關(guān)。 并且，使用人成纖維細胞進行了轉(zhuǎn)移因子的基因敲除(缺損)實驗，明確了皮膚病變瘢痕疙瘩[4]重癥化的原因基因之一的NEDD4中存在的轉(zhuǎn)移因子的插入是瘢痕疙瘩的遺傳風(fēng)險。 本研究刊登在科學(xué)雜志《Nature Genetics》在線版( 5月11日:日本時間5月12日)上。

將轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性納入遺傳統(tǒng)計分析，確定有瘢痕疙瘩風(fēng)險的變異

背景

基因?qū)捪嚓P(guān)分析( GWAS )和eQTL[5]分析等遺傳統(tǒng)計分析一般使用單核苷酸多態(tài)性( SNP )，但源于長鏈序列插入缺失的多態(tài)性也有可能導(dǎo)致異常的基因表達和疾病。 但是，由于分析方法的技術(shù)問題，這種多態(tài)性從未用于遺傳統(tǒng)計分析。 因此，如果在遺傳統(tǒng)計分析中納入單核苷酸多態(tài)性以外的變異，就有可能發(fā)現(xiàn)迄今為止被忽視的遺傳性疾病風(fēng)險。 “轉(zhuǎn)移因子(轉(zhuǎn)座子)”是存在于基因組中，插入到基因組各處的長鏈序列。 個人間有無轉(zhuǎn)移因子的“轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性”，約占人類長鏈序列插入多態(tài)性的25%。 但是，由于至今為止還沒有正確鑒定轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性的方法，轉(zhuǎn)移因子對基因表達和疾病的影響還不清楚。 在此背景下，本研究通過編制準確鑒定轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性的軟件，并將轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性引入遺傳統(tǒng)計方法，考察了①人群之間的差異，②對基因表達的影響，③疾病風(fēng)險。

研究方法和成果

聯(lián)合研究小組首先制作了正確鑒定轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性的軟件。 檢測靈敏度(效率)在80%以上，假陽性率在6%以下，多態(tài)性的量的決定精度(正確性)在94%以上，可以正確檢測出人類基因組中存在的轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性的大部分。 該識別精度足以將轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性用于遺傳統(tǒng)計分析，也可以利用DNA微陣列[6]數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性的統(tǒng)計推斷(運算[7] )。 將開發(fā)的軟件應(yīng)用于通過國際1000人基因組計劃[8]收集的來自各種各樣人類群體的2,504人，調(diào)查了轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性。 結(jié)果，在包括日本人集團在內(nèi)的東亞人集團中，被稱為Alu[9]的轉(zhuǎn)移因子的插入與美國人集團、歐洲人集團、南亞人集團幾乎相同，而被稱為LINE-1[9]和SVA[9]的轉(zhuǎn)移因子的插入與美國人集團 。由此可以認為，人類群體之間轉(zhuǎn)移因子的轉(zhuǎn)移活性不同。

圖1人類群體特異性轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性的數(shù)量

分析了五個人類群體的轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性，計算了僅在特定人群中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性數(shù)量。 在用藍色條表示的東亞人集團中，與美國人集團、歐洲人集團和南亞人集團相比，LINE-1和SVA的多態(tài)性較多。 接下來，我們分析了包含轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性的eQTL。 通過國際項目GTEx[10]收集的838人，根據(jù)全部基因組數(shù)據(jù)統(tǒng)計推測轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性，對49個人類組織進行了eQTL分析。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與基因表達變化相關(guān)的1,073個eQTL (圖2a )。 檢定單核苷酸多態(tài)性和轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性哪一個在eQTL中發(fā)現(xiàn)得多，結(jié)果轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性在eQTL中發(fā)現(xiàn)頻率更高(圖2b )。 由此認為，轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性頻繁影響基因表達。

圖2含轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性的eQTL

• ( a )在49個人類組織中檢測到的包括轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性的eQTL的數(shù)量。 共發(fā)現(xiàn)了1,073個eQTL。 ( b )與單核苷酸多態(tài)性相比，轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性在eQTL中頻率較高。 為了確認在睪丸組織中檢測出的eQTL中是否存在較多的轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性，進行了置換檢測。 本檢測在考慮到距離基因的距離、周邊基因數(shù)等因素的基礎(chǔ)上，隨機選擇多個eQTL，調(diào)查該eQTL中含有多少單核苷酸多態(tài)性。 結(jié)果表明，與單核苷酸多態(tài)性相比，轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性在睪丸的eQTL中發(fā)現(xiàn)頻率較高。 p值表示進行1萬次置換時的經(jīng)驗概率。

最后，通過生物銀行日本( BBJ )收集的來自日本人集團的約18萬名被試驗者，根據(jù)DNA微陣列數(shù)據(jù)統(tǒng)計推測轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性，進行了42種疾病的GWAS。 結(jié)果表明，五種轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性(三個Alu和兩個LINE-1 )與三種疾病(瘢痕疙瘩、2型糖尿病、前列腺癌)密切相關(guān)。 在檢測到的轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性中，有一種( Alu )是東亞人群特異性多態(tài)性，人類歷史上近年來插入的人群特異性轉(zhuǎn)移因子可能也與疾病有關(guān)。 為了驗證轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性是否成為疾病風(fēng)險，我們著眼于插入與被稱為瘢痕疙瘩的皮膚病變有密切關(guān)系的轉(zhuǎn)移因子LINE-1。 在瘢痕疙瘩重癥化的致病基因之一NEDD4注1 )的內(nèi)含子(未翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域)中發(fā)現(xiàn)了該LINE-1的插入(圖3左)。 通過基因組編輯技術(shù)[11]制備了敲除(缺失) LINE-1插入的人成纖維細胞，研究了LINE-1插入對NEDD4表達的影響，結(jié)果表明LINE-1插入能上調(diào)NEDD4的表達。 由此可以認為，LINE-1插入使NEDD4表達上調(diào)，是引起皮膚病變重癥化的瘢痕疙瘩的風(fēng)險因素。

圖3上調(diào)瘢痕疙瘩重癥化致病基因之一NEDD4表達的轉(zhuǎn)移因子插入

• (左)使用生物銀行日本收集的約18萬人的基因組數(shù)據(jù)的GWAS表明，存在于NEDD4的內(nèi)含子(未翻譯成蛋白質(zhì)的區(qū)域)中的轉(zhuǎn)移因子插入( LINE-1的插入)與瘢痕疙瘩的發(fā)生和病情相關(guān) (右)存在于NEDD4的LINE-1插入作為增加NEDD4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物( mRNA )的增強子。 人成纖維細胞中LINE-1插入的敲除(缺失)實驗表明，LINE-1的插入可上調(diào)NEDD4的表達。 p值表示t測試的結(jié)果。

• 注1)Fujita M .等，NEDD4參與瘢痕疙瘩形成過程中的炎癥發(fā)展。j .投資。皮托爾。, 139(2), 333-341 (2019).

今后的期待

本研究成果是著眼于迄今為止被忽視的基因組變異的研究，通過本研究開發(fā)的軟件在各種疾病生物庫中的應(yīng)用，可以期待加速確定導(dǎo)致疾病的基因組變異。 另外，確定這種疾病的遺傳因素，有望為發(fā)展適合每個患者的診斷、預(yù)防、治療的“基因組醫(yī)療”做出貢獻。 另外，在生物科學(xué)數(shù)據(jù)庫中心注2 ) ( NBDC，Research ID: hum0014.v28 )中，理研獨自構(gòu)筑了GWAS的分析結(jié)果的日本人集團基因組關(guān)聯(lián)分析信息數(shù)據(jù)庫 以這次的分析結(jié)果為基礎(chǔ)展開了很多研究，可以期待進一步的研究成果。

• 注2 )在生物科學(xué)數(shù)據(jù)庫中心新選項卡中打開注3 )在日本人集團基因組相關(guān)分析信息數(shù)據(jù)庫“Jenger”(生命醫(yī)科學(xué)研究中心基因組分析應(yīng)用研究小組)的新選項卡中打開

補充說明

• 1 .轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性 轉(zhuǎn)移因子存在于基因組中，是被復(fù)制并插入基因組不同位置的序列，稱為“運動基因”和“轉(zhuǎn)座子”等。 是插入到基因組各處的變異源，有時會破壞基因或改變基因表達。 人類歷史上近年來發(fā)生的源于插入的轉(zhuǎn)移因子序列僅在部分人類基因組中發(fā)現(xiàn)，這種轉(zhuǎn)移因子插入的個體間差異稱為轉(zhuǎn)移因子多態(tài)性。 2 .基因組寬相關(guān)分析( GWAS )，單核苷酸多態(tài)性 單核苷酸多態(tài)性是指基因組個人之間的差異中，由a、c、t、g組成的人類基因組堿基序列中的一處差異。 基因組關(guān)聯(lián)分析( GWAS )是了解性狀的遺傳關(guān)聯(lián)的方法，一般使用單核苷酸多態(tài)性進行分析。 將有無疾病和量的性狀等作為目的變量，將多態(tài)性的量的信息和各種共變量作為說明變量進行模型化，評價多態(tài)性的關(guān)聯(lián)。 GWAS是Genome-Wide Association Study的縮寫。 3 .生物銀行日本( BBJ ) 以日本人集團約27萬人為對象的疾病生物銀行。 在日本醫(yī)療研究開發(fā)機構(gòu)的基因組醫(yī)療實現(xiàn)生物銀行活用程序“以活用為目的的日本疾病生物銀行的運營管理”中進行運營，將DNA樣本和血清樣本與臨床信息一起保管，提供給研究者。 從2003年開始在東京大學(xué)醫(yī)科學(xué)研究所內(nèi)設(shè)立。 詳情請參考生物銀行日本網(wǎng)站新標簽中打開。 4 .瘢痕疙瘩 指皮膚傷口硬化隆起，出現(xiàn)發(fā)癢和疼痛癥狀的狀態(tài)。 外傷、痤瘡手術(shù)導(dǎo)致的創(chuàng)傷等皮膚損傷是發(fā)生的契機。 人成纖維細胞的增殖與瘢痕疙瘩的形成相關(guān)。 5.eQTL 參與基因表達量個體差異的基因組區(qū)域。 eQTL是expression quantitative trait locus的縮寫。 6.DNA微陣列 用于檢測遺傳多態(tài)性(主要是單核苷酸多態(tài)性)的分析儀器。 在基板上高密度地配置固定著DNA的部分序列，可以檢測數(shù)十萬到數(shù)百萬的遺傳多態(tài)性。 7 .計算 一種遺傳統(tǒng)計學(xué)方法，用DNA微陣列測定數(shù)十萬至數(shù)百萬處單核苷酸多態(tài)性的基因型后，利用所得基因型推測未進行實驗測定的遺傳變異。 具有不需要對被檢者進行全基因組測序，可以減少時間和費用的優(yōu)點。 8 .國際1000人基因組項目 以調(diào)查人類集團間的遺傳多樣性為目標，進行了世界各地的人類全基因組測序的國際研究計劃。 現(xiàn)在，公開了來自各種各樣的人類集團的3，000人以上的高復(fù)蓋范圍全基因組數(shù)據(jù)。 9.Alu、LINE-1和SVA 存在于人類基因組中，現(xiàn)在仍有轉(zhuǎn)移活性的轉(zhuǎn)移因子的種類。 Alu約300個堿基長，一個人的基因組中可以看到約2,500個拷貝的多態(tài)性。 LINE-1長約6,000個堿基，一個人的基因組中可以看到約500個拷貝的多態(tài)性，SVA長約2,000個堿基，一個人的基因組中可以看到約100個拷貝的多態(tài)性。 10.GTEx 以構(gòu)筑關(guān)于人類組織特異性基因表達量和基因組多態(tài)性的大規(guī)模數(shù)據(jù)為目標的國際項目。 從死后的捐贈者那里接受臟器和組織的提供，分析人的每個組織的基因表達量，收集數(shù)據(jù)。 GTEx是Genotype-Tissue Expression的縮寫。 11 .基因組編輯技術(shù) 利用能夠切斷特定DNA序列的人工核酸酶切斷基因組DNA，進行基因敲除和敲入等基因改變的技術(shù)。

聯(lián)合研究組

理化研究所 生命醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心 基因組免疫生物學(xué)理研白眉研究小組 理研白眉研究小組組長Nicholas F. Parrish (尼古拉斯·帕里什) 基礎(chǔ)科學(xué)特別研究員小島將平 研究兼職(研究當時)何美玲 研究生(研究當時)齋藤優(yōu)花 技術(shù)人員(研究當時) Erica H. Parrish (埃里卡·帕里什) 技術(shù)人員藤井麻美 基礎(chǔ)科學(xué)特別研究員Steven M. Heaton (斯蒂芬·希滕) 研究員小邂逅惠 特別研究員(研究當時) Anselmo J. Kamada (安塞爾莫鐮田) 基礎(chǔ)技術(shù)發(fā)展研究小組 隊長桃澤幸秀 技術(shù)人員(研究當時)遠藤美紀子 技術(shù)人員(研究當時)髙田定曉 技術(shù)人員(研究當時)水越美咲 基因組分析應(yīng)用研究小組 隊長寺尾知可史 特別研究員曳野圭子 心血管基因組信息學(xué)研究小組 隊長伊藤熏 客座研究員小山智史 人類免疫遺傳研究小組 隊長石垣和慶 理研-IFOM癌癥基因組學(xué)聯(lián)合研究小組 團隊領(lǐng)導(dǎo)村川泰裕 生物資源研究中心細胞材料開發(fā)室 室長中村幸夫 高級技師野口道也 東京大學(xué)研究生院新領(lǐng)域創(chuàng)成科學(xué)研究科醫(yī)學(xué)信息生命專業(yè) 復(fù)雜性狀基因組分析領(lǐng)域 教授鐮谷洋一郎 早稻田大學(xué)理工學(xué)術(shù)院先進理工學(xué)部 教授濱田道昭 研究生武田淳志

研究支援

本研究是日本學(xué)術(shù)振興會( JSPS )科學(xué)研究費資助事業(yè)基礎(chǔ)研究( b )“皰疹病毒嵌入基因組和再活化:與從大規(guī)模分析中探索的疾病的關(guān)聯(lián)(研究代表者: Nicholas F. Parrish )”、 同基礎(chǔ)研究( s )“基因組免疫:內(nèi)源病毒抗病毒活性的工作原理闡明和作為功能資源的確保(研究代表者:朝長啟造，研究分擔(dān)者: Nicholas F. Parrish )”，同年輕人研究“轉(zhuǎn)移因子的插入多態(tài)性與疾病的基因組廣度相關(guān)分析(研究代表者) 公益財團法人痛風(fēng)尿酸財團研究資助“來自基因組轉(zhuǎn)移因子的基因組結(jié)構(gòu)多態(tài)性引起的尿酸值異常:使用20萬日本人基因組的基因組廣度相關(guān)分析(研究代表者: Nicholas F. Parrish )”、 理化學(xué)研究所獎勵課題“ongoing virus integration in the diverse human genomes:comprehensive survey and functional implication (研究代表者:小島將平)”“deteteted tal infection of endogenous viruses in human cell lines (研究代表:野口道也)”，與理化研究所基于國際戰(zhàn)略的第四個中期長期計劃中的戰(zhàn)略性研究合作伙伴開展國際合作(研究代表: Nicholas f.papar 由日本醫(yī)療研究開發(fā)機構(gòu)( AMED )基因組研究生物銀行事業(yè)“以活用為目的的日本疾病生物銀行的運營管理(研究代表者:山梨裕司)”資助進行。

原論文信息

• Shohei Kojima*, Satoshi Koyama, Mirei Ka, Yuka Saito, Erica H. Parrish, Mikiko Endo, Sadaaki Takata, Misaki Mizukoshi, Keiko Hikino, Atsushi Takeda, Asami F. Gelinas, Steven M. Heaton, Rie Koide, Anselmo J. Kamada, Michiya Noguchi, Michiaki Hamada, Biobank Japan Project Consortium, Yoichiro Kamatani, Yasuhiro Murakawa, Kazuyoshi Ishigaki, Yukio Nakamura, Kaoru Ito, Chikashi Terao, Yukihide Momozawa, Nicholas F. Parrish*, "Mobile element variation contributes to population-specific genome diversification, gene regulation, and disease risk", Nature Genetics, 10.1038/s41588-023-01390-2

主講人

理化研究所 生命醫(yī)科學(xué)研究中心基因組免疫生物學(xué)理研白眉研究小組 理研白眉研究小組組長Nicholas F. Parrish (尼古拉斯·帕里什) 基礎(chǔ)科學(xué)特別研究員小嶋將平