一、了解NOTCH3基因突變類型與熱點，判斷突變的致病性

在HGMD（The Human Gene Mutation Database）專業(yè)版數(shù)據(jù)庫中目前CADASIL患者NOTCH3基因突變超過300種。絕大多數(shù)以錯義突變?yōu)橹鳎s95%），也有剪接突變、小的插入刪除、無義突變等類型。絕大多數(shù)突變（約98%）位于編碼34個EGFR的NOTCH3胞外域的2~23號外顯子內(nèi)，并且涉及典型的與CADASIL相關(guān)的半胱氨酸殘基改變^［5］。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)CADASIL患者中NOTCH3基因的突變主要集中在第3、4、5、6、8、11、18外顯子。然而不同人群NOTCH3基因突變熱點外顯子區(qū)域是存在差異的。其中白種人中NOTCH3基因第4外顯子突變率最高，其次位于第3和第11外顯子，而在亞洲國家和地區(qū)，比如日本的研究結(jié)果顯示突變最常見的區(qū)域是4號外顯子，其次是3、6、8號外顯子^［9］。至于我國CADASIL患者NOTCH3基因突變情況，文周等^［10］報道2009—2016年中國金域檢測中心檢測出275例NOTCH3基因突變陽性CADASIL患者，最常見的突變區(qū)域是第4以及11號外顯子。局部地區(qū)比如我國北部以3、4號外顯子多見，東部地區(qū)則為4、11號外顯子^［11］。Chen等^［12］通過分析我國大陸東南部情況結(jié)果也顯示第11號外顯子突變最為常見（41.07%），其次為第4以及第3號外顯子，分別占33.33%和13.69%。我國臺灣地區(qū)則與大陸東南部的研究結(jié)果相似，也是第11號外顯子為最常見的突變區(qū)域，其次是第4號外顯子^［13］。我們實驗室2017年總結(jié)了河南地區(qū)19個家系37例患者資料發(fā)現(xiàn)NOTCH3基因突變的熱點集中在11以及4號外顯子^［14］。

另外，NOTCH3基因突變熱點位點也具有明顯的地區(qū)和族群差異。比如：意大利中南部地區(qū)最常見的突變是第11號外顯子的R607C（21%），芬蘭為第3號外顯子的R133C（87.5%）^{［15, 16］}。東亞地區(qū)較為相似，韓國濟州島^［17］最常見的突變是第11號外顯子的R544C，而我國臺灣地區(qū)R544C位點占比高達70.5%^［13］。文周等^［10］的研究結(jié)果顯示R544C位點也是我國大陸地區(qū)最為常見的位點，達到23.27%。Chen等^［12］的研究主要集中在我國大陸東南部，最主要的突變位點是第11號外顯子的R607C（19.05%）、R544C（15.48%）以及第3號外顯子的Arg90Cys（8.93%），其中R607C主要集中在江蘇、上海和浙江，而R544C集中在福建與臺灣。東亞地區(qū)比較特別的是日本，最為常見的突變位點是R133C（23%）、R75P（13%）以及R182C（13%）^［9］。

雖然CADASIL患者中NOTCH3基因突變主要是導致半胱氨酸數(shù)量改變的突變（文中簡稱半胱氨酸突變），然而隨著測序的普遍，也有不少考慮為CADASIL的患者檢測出NOTCH3基因不涉及半胱氨酸的改變（文中簡稱非半胱氨酸突變）。目前，這些突變的致病性是存在爭議的，有的學者認為屬于基因多態(tài)性，而非致病性突變。這種情況在歐美發(fā)生概率極低，在日本、韓國等人群中較多，中國也有案例報道，其臨床意義仍有待進一步探索。據(jù)此Mui?o等^［18］提出了1個標準可以參考，即若符合以下5點，則該突變有致病意義：（1）CADASIL典型的臨床表現(xiàn)；（2）MRI顯示彌漫性腦白質(zhì)損傷；（3）NOTCH3基因全外顯子檢測且排除了半胱氨酸突變；（4）突變?yōu)榉嵌鄳B(tài)性；（5）活檢發(fā)現(xiàn)嗜鋨顆粒沉積。根據(jù)這個標準，我們實驗室^［19］報道了5例CADASIL患者攜帶非半胱氨酸突變，分別為R75Q、D80G、V237M、S1418L以及R1761L。同時分析了非半胱氨酸突變患者的臨床和影像學特征，與經(jīng)典型CADASIL相比非常相似并無明顯區(qū)別。雖然總結(jié)的病例較少，但這是國內(nèi)系統(tǒng)分析非半胱氨酸突變潛在致病性以及臨床特征的首次報道，大大提高了對疾病的認知程度，也為我們探尋CADASIL的致病機制提供了新的線索。

隨著人類基因組計劃的完成，測序技術(shù)不斷迭代，測序成本呈超摩爾定律的急劇下降，使得人類積累的基因變異數(shù)據(jù)越來越多。如何解讀這些海量的數(shù)據(jù)是后基因組時代的挑戰(zhàn)，對于NOTCH3基因也不例外。目前絕大多數(shù)還是在病例中發(fā)現(xiàn)變異，可以根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學和基因組學會（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）分級標準判斷基因變異是否具有致病性，有條件的還可以進一步進行細胞功能以及動物模型研究。ACMG撰寫了英文版的分級標準^［20］，我國賀林院士牽頭組織專家也進行了中文版的編寫^［21］。遺傳變異可分為致病的、可能致病的、良性的、可能良性的、意義不明的5個等級。在這個基礎(chǔ)之上，具體到疑似CADASIL患者NOTCH3基因變異的判斷，一般說來EGFR區(qū)域內(nèi)的涉及半胱氨酸的突變致病性爭議不大，而那些非半胱氨酸突變，或是非EGFR區(qū)域內(nèi)的突變，一定要結(jié)合臨床、影像、病理等方面信息，特別是皮膚活檢GOM沉積或是NOTCH3胞外域免疫組化，做到具體問題具體分析。

二、總結(jié)不同基因型臨床及影像特征，揭示基因型與表型之間關(guān)聯(lián)

遺傳學一直致力于探尋基因型與表型之間的關(guān)系，希望根據(jù)不同基因型對疾病表型進行一些預測與判斷，從而輔助臨床診斷或是判斷預后。攜帶NOTCH3基因EGFR重復區(qū)域內(nèi)涉及半胱氨酸突變的患者通常表現(xiàn)出比較典型的CADASIL癥狀，比如最常見的臨床癥狀為偏頭痛（尤其是白種人，亞洲人少見）、反復腦卒中發(fā)作、認知障礙、情感障礙。影像學以白質(zhì)高信號（尤其是顳極和外囊）、腔隙性梗死為主，伴或不伴微出血及血管周圍間隙。

由于奠基者效應的存在，在某些地區(qū)某一種特定突變型患者比較多，學者們就有可能對其進行詳細系統(tǒng)的研究。比如研究比較多的R544C突變。Lee等^［17］研究了韓國濟州島73例攜帶NOTCH3基因R544C突變的CADASIL患者，發(fā)現(xiàn)受試者的平均年齡為62.2歲（34~86歲）。腦梗死是最常見的表現(xiàn)（37%），其次是認知障礙（32%）、頭痛（17%）、精神癥狀（16%）、腦出血（12%）、短暫性腦缺血發(fā)作（7%）和癲癇發(fā)作（1%）。并且與典型的CADASIL相比，發(fā)病年齡較晚，缺血性或出血性發(fā)作患者的年齡為（64.9±10.9）歲（范圍41~86歲）。我國臺灣地區(qū)CADASIL患者中NOTCH3基因R544C突變與前顳葉受累頻率較低、發(fā)病年齡較晚和認知功能障礙頻率較高有關(guān)^［13］。在另一項我國臺灣地區(qū)的研究^［22］中，發(fā)現(xiàn)NOTCH3基因R544C也是小血管梗塞性（small vessel occlusion，SVO）腦卒中重要的風險因素。在調(diào)整血管危險因素后，攜帶p.R544C變異體導致腦卒中的風險增加了3.40倍，SVO腦卒中的風險增加了11.05倍（P值分別是0.000 1和3.9×10^-10）。

至于非半胱氨酸突變的表型，也有學者進行了探索。Xiromerisiou等^［23］對發(fā)表的NOTCH3基因突變進行了廣泛的文獻研究，并對所有已發(fā)表的NOTCH3突變病例進行了系統(tǒng)的回顧。他們發(fā)現(xiàn)半胱氨酸和非半胱氨酸突變患者的臨床表現(xiàn)和表型嚴重程度沒有顯著差異。然而，半胱氨酸與非半胱氨酸突變患者相比，發(fā)病年齡顯著更早（平均差異7.8歲，95%CI 2.2~13.5，P=0.009），分別為43歲和51歲。韓國的一項研究結(jié)果顯示：兩者臨床特征與體征差異無顯著性，非半胱氨酸突變患者在前顳葉腦白質(zhì)改變的頻率低于半胱氨酸突變患者，而其他部位腦白質(zhì)以及腦微出血的頻率和程度兩者之間是相似的，也就是說經(jīng)典型的半胱氨酸突變腦白質(zhì)改變更易出現(xiàn)在前顳葉^［24］。

除了突變類型以外，突變的位置也會影響表型。不同外顯子區(qū)域患者發(fā)病年齡存在差異，Chen等^［12］發(fā)現(xiàn)攜帶第11號外顯子突變的患者發(fā)病年齡一般在50歲左右，較其他外顯子突變患者晚。至于CADASIL首發(fā)臨床癥狀與NOTCH3基因不同外顯子突變之間的關(guān)聯(lián)，翟宇和蘇敬敬^［11］的研究結(jié)果提示NOTCH3基因第4號外顯子突變的患者以運動、語言障礙起病占多數(shù)，而第19號、20號外顯子突變的患者以認知障礙起病更多見。Rutten等^［25］研究結(jié)果顯示NOTCH3突變位點位于EGFR 1~6區(qū)域的比突變位點在7~34區(qū)域的患者具有更加嚴重的臨床表型，腦卒中發(fā)病年齡更早，預期生存期更短，腦白質(zhì)損傷負擔也更嚴重。目前已有很多軟件可以幫助判斷基因變異是否有害。Xiromerisiou等^［23］根據(jù)CADD（combined annotation-dependent depletion）算法，對NOTCH3基因不同單核苷酸以及插入刪除變異的危害進行致病性評分，發(fā)現(xiàn)致病性評分似乎完全受不同外顯子位置的影響（P<0.001），與表型嚴重程度無關(guān)。

我們知道CADASIL是常染色體顯性遺傳病，即NOTCH3基因雜合突變即可致病，不過在實踐中也有少數(shù)CADASIL患者NOTCH3純合或復合雜合突變被報道。在其中一些患者中，表型被發(fā)現(xiàn)更嚴重，而另一些患者報告的臨床嚴重程度類似于雜合突變攜帶者。Al-Shaar等^［26］報道了1個受累3代的攜帶R1231C突變的CADASIL家系，13例患者中7例為純合子，6例為雜合子，純合子個體與雜合子個體相比，早期發(fā)病的臨床和影像表型略顯嚴重。而He等^［27］報道的1個兄弟二人均攜帶R587C純合子的CADASIL家系中，他們表現(xiàn)為缺血性腦卒中、步態(tài)不穩(wěn)、認知障礙和精神障礙等，與先前報道的雜合子相同突變的患者相似?？偟膩碚f，迄今為止所描述的純合突變患者具有正常的CADASIL疾病譜中的表型，嚴重程度的變化不明顯，可能歸因于CADASIL中所見的自然異質(zhì)性。

雖然有學者認為一些突變可能與更溫和或更嚴重的表型有關(guān)，但到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)明確的基因型-表型相關(guān)性?？偟膩碚f，攜帶EGFR區(qū)域內(nèi)涉及半胱氨酸數(shù)目改變的突變以及位置越靠EGFR前段的突變，CADASIL患者癥狀越典型、臨床癥狀越嚴重。NOTCH3基因突變純合子個體臨床表型并不一定比雜合子個體更嚴重。由于疾病的嚴重程度可能在家庭成員之間，甚至在單卵雙胞胎之間有所不同，因此，除NOTCH3基因突變外，其他因素很可能在疾病中發(fā)揮表型修飾作用，比如個體的遺傳背景、血管危險因素、生活方式等多種內(nèi)外因素。遺傳因素方面，載脂蛋白E（ApoE）基因是研究最多的風險基因，不過結(jié)果不盡相同。Gesierich等^［28］發(fā)現(xiàn)ApoE ε2型與CADASIL患者的腦白質(zhì)高信號（white matter hyperintensities，WMH）的體積有關(guān)，Lee等^［29］發(fā)現(xiàn)ApoE ε4型提高了韓國CADASIL患者癡呆的風險，而Singhal等^［30］的研究結(jié)果則顯示ApoE ε4型對于患者的表型是沒有影響的。另外，Opherk等^［31］結(jié)合從歐洲7個中心收集的517例CADASIL患者的Affymetrix芯片數(shù)據(jù)進行了全基因組關(guān)聯(lián)研究，以確定影響CADASIL患者WMH體積的數(shù)量性狀基因位點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多基因評分與CADASIL受試者的WMH體積有關(guān)，多個微小效應的遺傳變異影響WMH負擔，不過并沒有單個核苷酸多態(tài)性達到全基因組范圍的顯著性差異。在其他非遺傳因素方面，有研究^{［7，30］}結(jié)果表明高血壓、吸煙會增加CADASIL患者發(fā)生腦卒中的風險，而高同型半胱氨酸水平與偏頭痛的風險增加有關(guān)。另一篇文獻^［32］報道家族中CADASIL患者與健康家系成員之間攜帶的所有血管風險因素的頻率是相似的。在患者中，糖尿病與腦卒中發(fā)生年齡較早相關(guān)。因此對于沒有有效治療手段的CADASI，控制血管危險因素還是十分必要的?？傊?，疾病是遺傳與環(huán)境互相作用的結(jié)果。即使對于單基因遺傳病，除致病基因本身的突變形式與位置影響疾病的表型以外，其他方面的因素也會微效地修飾表型。

三、嘗試CADASIL基因治療，破局罕見病研究

CADASIL作為一種單基因遺傳病，目前沒有有效的治療手段。由于該病特征性的病理改變是NOTCH3胞外域異常沉積，因此有學者在CADASIL模型鼠上探索NOTCH3胞外域單克隆抗體5E1的治療潛力。結(jié)果顯示長期使用5E1不能減弱NOTCH3胞外域或GOM的沉積，也未能停止白質(zhì)損害的發(fā)展，但對神經(jīng)活動和局部應用血管擴張劑引起的受損腦血流反應以及腦動脈正常的肌源性反應有明顯的保護作用^［33］。另一方面，基因治療也是這一類單基因遺傳病治療的一個重要研究方向，有學者也開始了這方面的嘗試。2016年Rutten等^［34］通過設計針對包含致病性CADASIL突變熱點區(qū)域的外顯子4、5設計反義寡核苷酸，轉(zhuǎn)染CADASIL患者來源的腦血管平滑肌細胞，成功地實現(xiàn)了外顯子跳躍而不會影響NOTCH3信號傳導。外顯子4和5包含EGFR2的部分，EGFR3、4、5全部，以及部分EGFR6，經(jīng)過反義寡核苷酸介導，實現(xiàn)EGFR3/4/5的跳躍，使得2與6融合到一起。氨基酸第153位額外增加的無法配對的半胱氨酸可以與EGFR6中的半胱氨酸配對，從而形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。2020年該團隊另一項研究^［35］發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)存在自然發(fā)生的可導致NOTCH3基因外顯子跳躍的特殊現(xiàn)象。報道的CADASIL患者攜帶半胱氨酸突變（G498C），雖然理論上攜帶EGFR區(qū)域內(nèi)半胱氨酸突變的患者表型應該比較典型，但家系成員癥狀溫和，只有WMH，而且60歲以上的患者也沒有出現(xiàn)認知損害。研究發(fā)現(xiàn)突變位于第9號外顯子的邊界，影響了RNA的剪接從而造成整個第9號外顯子的缺失。這也側(cè)面印證了CADASIL患者“半胱氨酸糾正”可能降低NOTCH3蛋白聚集從而減輕癥狀，為治療提供潛在的可行性。

雖然這些研究只是CADASIL基因治療方面初步的嘗試，但意義重大深遠，為這種罕見病的治療開啟了新的研究方向，希望在不久的未來會有突破性的進展。