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IVD資訊 116篇原創(chuàng)內(nèi)容 公眾號(hào)
PCR技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，在遺傳病、病原體、癌基因等分子診斷領(lǐng)域和法醫(yī)鑒定等方面發(fā)揮了巨大作用。按照PCR技術(shù)的演進(jìn)，人們習(xí)慣性將PCR技術(shù)劃分為三代：普通PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qPCR）以及數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)。以前也介紹了很多關(guān)于qPCR相關(guān)知識(shí)，這期給大家分享另外兩種PCR技術(shù)——普通PCR技術(shù)和dPCR技術(shù)，以期讓大家對(duì)這些技術(shù)有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，其原理類(lèi)似DNA分子的天然復(fù)制過(guò)程，是將在待擴(kuò)增的DN 片段和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。該技術(shù)已成為分子生物學(xué)中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。該技術(shù)是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的 DNA 片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)「高溫變性—低溫退火 — 引物延伸」三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使 DNA 片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。①DNA模版：可以是雙鏈、單鏈、提取染色體的DNA、克隆的質(zhì)粒DNA；②引物：一對(duì)寡聚DNA，分別與模板兩側(cè)的3’端序列互補(bǔ)，可使DNA序列得到擴(kuò)增；③DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）：催化DNA合成；④緩沖液：提供DNA合成反應(yīng)所需的PH,離子強(qiáng)度等環(huán)境；⑤4種單核苷酸：dNTP,提供DNA合成原料。注：可以按照比例放大或者縮小體系，不同的PCR反應(yīng)需要優(yōu)化；按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行即可。優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)典方法，國(guó)際和國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)齊全；儀器試劑成本較低、PCR產(chǎn)物可以回收后做其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)：容易污染、操作繁瑣、只能定性分析、敏感性中等、存在非特異性擴(kuò)增，當(dāng)非特異條帶與目的條帶大小一樣時(shí)無(wú)法區(qū)分。PCR 是一種用于放大擴(kuò)增特定的 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復(fù)制，最大特點(diǎn)是能將微量的 DNA 大幅增加。因此，無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，只要能分離出一點(diǎn) DNA，就能用 PCR 加以放大，進(jìn)行比對(duì)。在普通 PCR 儀的基礎(chǔ)上增加一個(gè)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量 PCR 儀，其擴(kuò)增原理和普通 PCR 儀擴(kuò)增原理相同，只是 PCR 擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過(guò)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出，兩者具體差異見(jiàn)下表：注：靈敏度指的是PCR擴(kuò)增反應(yīng)能夠檢測(cè)到目的基因最小值。特異性指的是在 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中，專一性擴(kuò)增目的片段而非其他片段的性能。7、PCR實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及對(duì)策問(wèn)題1：陽(yáng)性對(duì)照有條帶，而樣本無(wú)結(jié)果原因：①模板含有抑制物，含量低；②Buffer 對(duì)樣品不合適；③引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解；④反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短。對(duì)策：①純化模板或者使用試劑盒提取模板 DNA 或加大模板的用量；②更換 Buffer 或調(diào)整濃度；③重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)）或者更換一管新引物；④降低退火溫度、延長(zhǎng)延伸時(shí)間。原因：①引物特異性差；②模板或引物濃度過(guò)高；③酶量過(guò)多；④Mg2+濃度偏高。對(duì)策：①重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式 PCR；②適當(dāng)降低模板或引物濃度；③適當(dāng)減少酶量；④降低 Mg2+濃度，或更換 mix。問(wèn)題3：GC-rich（正常范圍為40-60%，>60%為GC-rich）區(qū)域難以擴(kuò)增原因：GC-rich 區(qū)域需要更高的溫度才能打開(kāi)雙鏈，常規(guī)的變性溫度下可能解鏈不完全; 同時(shí)由于單鏈的 G+C 豐富區(qū)易于自身互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)而使 PCR 引物難以結(jié)合到模板上，DNA 聚合酶也難以延伸或延伸停止，結(jié)果出現(xiàn)嚴(yán)重的非特異性條帶，甚至擴(kuò)增不出靶基因。對(duì)策：①提高預(yù)變性溫度或變性時(shí)間，使雙鏈完全打開(kāi)；②TD-PCR（梯度 PCR ）；③換用熱啟動(dòng)酶或 mix；④增加 DMSO 等共溶劑，協(xié)助 DNA 變性，降低引物 Tm 值，提高產(chǎn)物擴(kuò)增特異性。問(wèn)題4：產(chǎn)物在凝膠上呈 Smear 狀態(tài)原因：①模板不純；②Buffer不合適；③退火溫度偏低；④酶量過(guò)多；⑤dNTPs、Mg2+ 濃度偏高。對(duì)策：①純化模板；②更換 Buffer 或 mix；③適當(dāng)提高退火溫度；④按濃度比例設(shè)置酶的添加量；⑤適當(dāng)降低 dNTPs 和 Mg2+ 濃度；⑥減少反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。問(wèn)題5：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。對(duì)策：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用；③各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了數(shù)字PCR的概念。dPCR是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于qPCR，dPCR對(duì)結(jié)果的判定不依賴于擴(kuò)增曲線循環(huán)Ct值，不受擴(kuò)增效率的影響，能夠直接讀出DNA的分子個(gè)數(shù)，能夠?qū)ζ鹗紭颖竞怂岱肿咏^對(duì)定量。分割單元數(shù)、熒光通道數(shù)、操作復(fù)雜性以及污染風(fēng)險(xiǎn)是評(píng)價(jià)數(shù)字PCR平臺(tái)的重要指標(biāo)。此外，使用多個(gè)數(shù)字PCR平臺(tái)互相驗(yàn)證和使用定值準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是評(píng)估數(shù)字PCR平臺(tái)的主要方法。dPCR：digital PCR（數(shù)字PCR），是一種基于泊松分布原理建立的核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。通過(guò)將待測(cè)樣本進(jìn)行極限稀釋，使每個(gè)反應(yīng)室中平均只有一個(gè)拷貝或者沒(méi)有目標(biāo)DNA分子，然后加入熒光信號(hào)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以檢測(cè)到低至一個(gè)拷貝的突變。目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒(méi)有模板的反應(yīng)器就沒(méi)有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。可以使用幾種不同的方法來(lái)分配樣品，包括微孔板、毛細(xì)管、油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過(guò)假設(shè)分子種群遵循泊松分布來(lái)估計(jì)不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過(guò)公式A=-ln[(N-X)/N]*N計(jì)算，從而解決了多個(gè)目標(biāo)分子存在于單個(gè)液滴中的可能性。優(yōu)點(diǎn)：實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量、更高的敏感性和特異性、可以檢測(cè)低拷貝樣品、操作過(guò)程和結(jié)果分析簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：儀器設(shè)備和試劑昂貴、操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、成本較高、檢測(cè)范圍較窄，此方法適宜于對(duì)ctDNA或者其他低濃度樣本的低頻突變進(jìn)行檢測(cè)，特別適用于“液體活檢”。基因表達(dá)：可對(duì)細(xì)微變化進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性佳。突變檢測(cè)：可檢測(cè)低含量的突變基因，突變序列檢測(cè)靈敏度高。拷貝數(shù)變異CNV檢測(cè)：可通過(guò)精確計(jì)量目的基因與參考基因，計(jì)算比值得到目的基因的拷貝數(shù)。二代測(cè)序數(shù)據(jù)驗(yàn)證：可直接對(duì)二代測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行絕對(duì)定量分析。5、與常規(guī)PCR方法相比，數(shù)字PCR的優(yōu)勢(shì)①可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量：常規(guī)PCR定量需要制定已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA曲線，但是由于待檢樣本與標(biāo)準(zhǔn)曲線不在統(tǒng)一體系，條件上會(huì)存在差異，另外加上PCR擴(kuò)增效率的差異從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。而數(shù)字PCR不受標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)影響，可進(jìn)行絕對(duì)定量。②樣本需求量低：適用于珍貴樣本或核酸降解嚴(yán)重的樣本。③靈敏度高：數(shù)字PCR是將傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系分割成數(shù)萬(wàn)個(gè)獨(dú)立PCR反應(yīng)，這些反應(yīng)可以精確地檢測(cè)很小的目的片段差異、單拷貝甚至低濃度的混雜樣本。且能避免非同源異質(zhì)雙鏈的形成。④高耐受性：由于目的序列被分配到多個(gè)獨(dú)立反應(yīng)體系中，顯著降低了背景信號(hào)和抑制物對(duì)反應(yīng)的干擾，擴(kuò)增基質(zhì)效應(yīng)大大減小。2013年dPCR被《麻省理工大學(xué)科技評(píng)論》評(píng)為十大突破技術(shù)之一，2017年入選《世界經(jīng)濟(jì)論壇》評(píng)出的全球十大新興技術(shù)，經(jīng)過(guò)幾年的發(fā)展，目前在國(guó)內(nèi)的臨床分子檢測(cè)已得以運(yùn)用。目前市場(chǎng)上主流dPCR包括：①Life Technologies 3D數(shù)字PCR（芯片式數(shù)字PCR）：可認(rèn)為是微孔數(shù)字PCR，主要是將20 ul反應(yīng)體系分散到20000個(gè)微孔中進(jìn)行反應(yīng)，變成20000個(gè)反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用CCD拍照，數(shù)陽(yáng)性反應(yīng)孔。②Bio-Rad 微滴數(shù)字PCR（油包水液滴式數(shù)字PCR）：將20ul反應(yīng)體系采用液滴反應(yīng)器形成20000個(gè)油包水反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)結(jié)束后，才有流式細(xì)胞術(shù)的原理，檢測(cè)每一個(gè)液體，數(shù)陽(yáng)性反應(yīng)的液滴數(shù)量。③RainDance 的數(shù)字PCR（油包水液滴式數(shù)字PCR）：原理與伯樂(lè)微滴數(shù)字PCR相同，但是其液體形成能力比伯樂(lè)強(qiáng)很多，理論上可以產(chǎn)生1000萬(wàn)個(gè)小油滴。其中Raindance的價(jià)格最高、Bio-Rad其次、Life Technologies價(jià)格最低。技術(shù)的進(jìn)步給PCR技術(shù)不斷地注入新的活力，使核酸檢測(cè)更方便、更準(zhǔn)確。目前三代PCR技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，也各有不同的應(yīng)用領(lǐng)域，不具有一代取代另一代的關(guān)系，科研工作者可根據(jù)自己的實(shí)際情況選擇適合的PCR技術(shù)！信息來(lái)源：明科生物，IVD聯(lián)盟
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