一、引言

多重PCR( multiplex polymerase chain reaction,MPCR)也稱復合PCR,是在常規(guī)PCR基礎上改進并發(fā)展起來的一種新型PCR擴增技術,即可在一個反應體系中加入兩對以上引物,同時擴增出多個核酸片段,由 Chambehian'于1988年首次提出,其反應原理、反應試劑和操作過程與常規(guī)PCR相同。多重PCR既有單個PCR的特異性和敏感性,又較之快捷和經(jīng)濟,在引物和PCR反應條件的設計方面表現(xiàn)出很大的靈活性。多重PCR還能提供內(nèi)部對照,指示模板的相對數(shù)量和質(zhì)量

當前臨床上對感染性疾病的診斷主要依靠傳統(tǒng)的微生物學方法以及血清學方法。經(jīng)典的微生物學方法不僅繁瑣、費時,并受諸多因素影響,容易漏檢自然變異株,并且不能檢測難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的致病微生物。血清學方法雖然發(fā)展較快,靈敏度也較高,但只能做追溯性診斷或提供間接的診斷依據(jù),不能進行快速鑒定,并且有些細菌之間有交叉凝集現(xiàn)象。因此,這些傳統(tǒng)的方法在鑒定方面日益顯現(xiàn)出不足。過去10年間,分子生物學的發(fā)展為微生物的基因型檢測和鑒定打開了一扇大門,這些發(fā)展開始影響到患者治療的很多方面。DNA雜交研究首先應用于確證細菌間的關系,對核酸雜交化學的認識,使發(fā)展核酸探針技術成為可能。但類似于表型指標,在某些情況下,雜交的方法也可能受到微生物能被分離和生長的限制。核酸擴增技術又為臨床微生物實驗室的病原體的檢測和鑒定鋪設了道路。體外能夠生長,一般來說不再是鑒定微生物所必須滿足的條件。之所以能夠如此,從根本上說是由于這些技術以特異核酸序列的酶學擴增代替了生物學擴增一培養(yǎng)生長。雖然任何PCR依賴的技術都不能區(qū)分活的和死的細胞,但由于具有其它方法不可替代的優(yōu)勢,PCR還是成為分子生物學中不可缺少的技術和方法。在過去20多年間,PCR技術和其它DNA信號與靶標擴增技術的發(fā)展已經(jīng)使這些分子診斷技術成為臨床上快速敏感診斷的關鍵性技術。一般PCR僅應用一對引物,通過PCR擴增產(chǎn)生一個核酸片段,主要用于單一致病因子等的鑒定。在診斷實驗室中,PCR技術的應用主要受成本的限制,有時是因不能獲得足夠的待測樣本體積。為了克服以上缺點,同時增加PCR技術的診斷能力,多重PCR的技術應運而生

自1988年 Chamberlin等首次提出這一概念起,多重PCR技術已被廣泛應用于核酸診斷的許多領域,包括基因敲除分析、突變和多態(tài)性分析、定量分析1以及RNA檢測等,在感染性疾病領域,多重PCR技術已經(jīng)顯示出它的價值,成為識別病毒、細菌、真菌和寄生蟲的有效方法。利用一次多重PCR反應,可同時檢測、鑒別出多種病原體,在臨床混合感染的鑒別診斷上具有其獨特優(yōu)勢和很高的實用價值

二、原理

多重PCR基本原理與常規(guī)PCR相同,區(qū)別是在同一個反應體系中加入一對以上的引物,如果存在與各對引物互補的模板,則它們分別結(jié)合在模板相對應的部位,同時在同一反應體系中擴增出一條以上的目的DNA片段。多重PCR反應體系的組成和PCR循環(huán)的條件需要經(jīng)過優(yōu)化以確保同時擴增幾個片段。理論上只要PCR擴增的條件合適,引物對的數(shù)量可以不限,但由于各種條件的限制,實際能夠擴增的引物對數(shù)量是有限的。

PR結(jié)果的分析方法有以下幾種,包括:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、核酸雜限制性酶切分析、核酸測序等,其中瓊脂糖凝膠電泳是最簡單、最快速的方法,但是與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比分辨率比較低。限制性酶切分析需要將PCR產(chǎn)物回收酶切后再次電泳,耗時費力,難以推廣應用。核酸測序是鑒定PCR產(chǎn)物最可靠的方法,但需要專門的測序儀器,并且需要花費的時間也比較長。如果要將鑒定感染性疾病病原的多重PR方法用于臨床及現(xiàn)場流行病學調(diào)查,瓊脂糖凝膠電泳是最佳的選擇

三、材料

1.常規(guī)的PCR反應體系所需試劑

①高壓過的超純水(高壓的目的是使其中的 DNase失活,以免降解模板DNA);

②PCR緩沖液(選用與所用聚合酶對應的緩沖液)

③4種dNTP混合物(每種dNTP的濃度為2.5mmol/L);

④引物(引物合成后,用超純水稀釋為10mmol/L);

⑤熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(不同廠家、不同批次的酶可能會有差異);

⑥D(zhuǎn)NA模板(盡量使用純化后的核酸作為模板)。

2.實驗儀器

PCR熱循環(huán)儀、核酸電泳儀、凝膠成像設備、離心機等

四、方法

多重PCR實驗設計遠比單個PCR復雜,并不是簡單地將多對特異性引物混合成一個反應體系,其反應體系的組成和反應條件需要根據(jù)實驗結(jié)果反復調(diào)整,以適應同時擴增多個片段的需要。設計多重PCR反應體系時必須仔細考慮其擴增的區(qū)域、擴增片段的大小、引物的動力學及PCR循環(huán)條件的最優(yōu)化等。

一）選擇目標基因

由于多重PCR在同一個反應體系中需要加入多對引物,而模板直接影響擴增的結(jié)果分析,這就導致了擴增模板的選擇至關重要。同時,擴增區(qū)域的選擇必須符合分析的目的,如通常對于致病微生物,需要選擇其保守序列,如16sRNA,或者毒力基因、毒力相關基因,以防止檢測到非致病突變體而無法解釋結(jié)果;對于需要分型的對象來說,需要選擇它們之間有差異的保守序列進行擴增;對于高度同源的序列來說,可以用相同的引物進行擴增,但獲得的陽性結(jié)果需要利用特異探針雜交或限制性酶切進行進一步確定;缺失分析選擇擴增外顯子;法醫(yī)學鑒定個體差異選擇擴增高度多態(tài)性標志;轉(zhuǎn)基因檢測則選擇轉(zhuǎn)入的動植物基因座;性別鑒定一般選擇X或Y性染色體上特有的基因座

對于含有多個外顯子的基因缺失分析來說,可選擇缺失熱點較廣區(qū)域或缺失密集區(qū)域。相鄰近的外顯子可用跨越這兩個外顯子的引物進行擴增。

二)引物設計

引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸序列,使其能有效地擴增模板DNA序列。因此,引物的優(yōu)劣直接關系到PCR的特異性與靈敏度。要確定引物的位置,首先需要知道所選擇的基因引物與模板結(jié)合部位的詳細DNA序列信息。在多重PCR中,為了保證擴增效率,所有的引物對必須優(yōu)化到相近的擴增條件。因此,多重PCR的引物設計除了要滿足一般PCR引物設計的原則外,還要注意以下幾個問題:①各引物之間不能互補,尤其避免3的互補,以免形成二聚體,引物設計好以后進行PCR擴增,以檢驗引物之間是否配對形成二聚體;②各引物與其它擴增片段和模板不能存在較大的互補性,擴增片段之間也不能有較大的同源性;③對于引物的長

度、(G+C)含量、T值要求盡量一致;④各引物擴增產(chǎn)物的片段大小要有一定的差別,以便于用電泳的方法進行區(qū)分。一般來說,產(chǎn)物片段越大,其長度的差別也應該越大。這就給多重PCR引物的設計帶來了一定的難度

(三)核酸提取

核酸依賴的檢測方法受目標核酸純化的影響,核酸的純化程度決定了核酸方法的應用。多重PCR的優(yōu)勢在于快速、系統(tǒng),主要用于臨床標本的檢測,包括血液、組織、糞便等,同時多重PR對核酸模板的要求比較高,所以核酸的提取純化顯得尤為重要,直接與擴增結(jié)果

一般來說,通過煮沸裂解細菌制備模板可以滿足普通PCR反應,但是用于多重PCR反應會存在很多問題。在條件允許的情況下,多重PCR需要以純化的DNA為模板,可以確保多重PCR的順利進行。

(四)單位點PCR(也叫單引物PCR)

在進行多重PCR之前,必須先對每對引物進行單位點PCR。確定每對引物進行單位點PCR時條件如表14-1所列

反應完成后比較擴增結(jié)果,確保在相同的循環(huán)條件下所有的引物都能擴增出對應的產(chǎn)物條帶,以確保引物能夠特異性擴增對應的目標序列

(五)多重PCR(引物等濃度混合)

反應體系中各對引物等濃度混合,體系中其它各成分的濃度不變,應用與單位點PCR相同的反應條件進行多位點同時擴增,根據(jù)擴增結(jié)果對多重PCR反應體系及反應條件進行調(diào)整,具體操作如下面所述

(六)優(yōu)化多重PCR反應體系及反應條件

多重PCR的反應體系和反應條件基本與單位點PCR相同,但也不能一蹴而就,必須使多重PCR反應中每對引物對應的靶點都能獲得足夠的擴增量,并且擴增產(chǎn)物之間的產(chǎn)量應該基本影響多重PCR擴增效果的因素可以分為反應體系和反應條件兩大類。其中反應體系包括引物、緩沖液、 Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2等,反應條件包括退火溫度、延伸溫度、延伸時間,循環(huán)數(shù)等

1.反應體系的優(yōu)化

(1)引物濃度在多重PCR體系中,引物用量和擴增的目的片段長度有著正比內(nèi)在關系,即擴增片段越長,所需引物就越多,片段越短所需引物相對就越少。同時,多重PCR擴增中每增加一重PCR擴增,引物間相互影響就加大,這就勢必影響到擴增的效果。為了降低這種不利影響,選擇適當?shù)囊镩g濃度是確保多重PCR成功的一個關鍵因素。先對不同的引物進行單個PCR擴增,確定單個PCR各引物的最佳濃度,然后按照多重PCR的實驗流程,進行兩個或多個引物對的多重PCR預實驗。多對引物會增加3末端引物互補的可能性,形成引物二聚體;也有可能發(fā)生一個擴增片段抑制另一個擴增片段的情況,這就導致了擴增結(jié)果并不是均一的。即使在優(yōu)化了循環(huán)條件后,某些基因的擴增產(chǎn)物仍不明顯。多重PCR反應體系優(yōu)化經(jīng)?？梢杂龅接袀€或兩個靶位點的擴增產(chǎn)物很少甚至沒有擴增產(chǎn)物,而其它引物的擴增效率都很好的情況。為解決這一問題,可以通過適當?shù)卣{(diào)整引物的相對濃度加以解決,增加弱條帶的引物量,減少亮條帶的引物量。降低擴增效率高的引物對濃度比增加擴增效率低的引物濃度更有助于提高擴增效率低的產(chǎn)物的產(chǎn)量。多重PCR反應中各引物的濃度差異一般都憑經(jīng)驗獲得。只有在調(diào)整引物濃度達不到要求時才考慮調(diào)整別的反應條件,例如改變反應體系中Mg2或KC的濃度等。

有些情況,例如擴增產(chǎn)物是序列相似但長度不同的擴增片段,最短的產(chǎn)物可能擴增得更好,尤其是有些擴增片段共用一個引物的時候。這種情況可以通過長擴增片段引物啟動PCR幾個循環(huán)后再加入擴增短片段的引物的方法避免,也可以通過降低擴增短片段的引物來解決。理論上講,引物和基因靶序列的摩爾比至少為103:1,如此過量的引物才能確保模板DNA一且變性就與引物退火,而不是與其自身退火。一般引物量至少要10倍于模板量

(2)模板及模板濃度從血和新鮮組織中提取的DNA,濃度和質(zhì)量均能滿足多重PCR的要求。對于從菌體提取的DNA,為了減少樣品對擴增結(jié)果的影響,裂解液中加入的菌量不能太多否則會因裂解不完全,菌體蛋白抑制DNA聚合酶的活性,造成假陰性結(jié)果

要達到穩(wěn)定的結(jié)果,每個樣品都應該測定濃度,實際工作中往往是抽樣檢測。所以,樣本模板濃度往往參差不齊,導致每個樣本擴增效率不完全均等,有時還會出現(xiàn)擴增失敗的現(xiàn)象。此時要考慮模板的有效濃度,適當加以調(diào)整。幾種不同來源的模板DNA的濃度為:哺乳動物基因組DNA100g/ml;酵母基因組DNA1g/ml;細菌基因組DNA0.1pg/ml;質(zhì)粒DNA1~5ng/ml)dNTP和MgCl2的濃度dNTP和MgCl2是PCR反應體系中的重要成分,因此對dNTP和MgC1的濃度進行優(yōu)化也是很必要的

PCR反應中一般用的dNTP和MgCl2的濃度分別為200m/L和1.5mmol/L。Mg2濃度在很大程度上影響擴增的特異性,Mg2+一般正比于dNTP的濃度,這個比值確定好后可以在調(diào)整其它反應條件時保持恒定。當保持dNTP的濃度不變,隨著MgCl2濃度的升高,反應的特異性逐漸增強,但當增加到一定程度后,反應產(chǎn)物幾乎為零。PCR反應中,dNTP和MgCl2的濃度應該平衡,這可能是因為dNTP能夠結(jié)合鎂離子,而 Taq DNA聚合酶發(fā)揮活性需要游離的鎂離子。另外,dNTP母液對于反復凍融十分敏感,反復凍融3~5次后,多重PCR反應常常不能很好進行,擴增產(chǎn)物幾乎完全不可見,但dNTP的這種低穩(wěn)定性在單一基因擴增中并不明顯。

(4)PCR緩沖液(KCD的濃度如果多重PCR系統(tǒng)性地對擴增長的PCR產(chǎn)物有傾向性,最佳的選擇是設計一系列多重PCR實驗,固定Mg濃度(1.5mmo/L),依次遞增KCl的濃度(1.0~2.0倍),對每對引物進行再優(yōu)化。相反,如果傾向于優(yōu)先擴增較短的產(chǎn)物,則應在保持KCl濃度不變的情況下逐步提高Mg2濃度(直至4.5mol/L)。如果所有產(chǎn)物的擴增效率都很低試著提高模板和熱穩(wěn)定DNA聚合酶的濃度。如果沒有改善,則成倍增加所有引物的濃度并采用復性和延伸溫度依次降低2℃的降落PCR。

PCR緩沖液的濃度從1×提高到2×可以明顯提高多重PCR的效率,這種調(diào)節(jié)作用比調(diào)節(jié)DMSO、甘油或BSA更重要。通常產(chǎn)生長片段擴增產(chǎn)物的引物在低鹽濃度下擴增結(jié)果更好,而生短片段擴增產(chǎn)物的引物在高鹽濃度下擴增結(jié)果更好,高鹽濃度會使長片段擴增產(chǎn)物難于變性解鏈

(5) Taq dNA聚合酶隨著多重PCR體系中引物對數(shù)目的增多,dNTP和聚合酶的量也要相應增加。不同廠家的酶質(zhì)量也有差異,需要做濃度梯度實驗,尋找最佳的用酶量。使用過多的Tag dnA聚合酶會導致不同基因擴增不平衡及背景的輕微增高,反應的特異性降低?？梢栽?5反應體積中加入2U,然后根據(jù)擴增結(jié)果進行輕微的調(diào)整

(6)輔助劑(如DMSO、甘油、BSA)的應用在多重PCR反應體系中加入50~100ml/的DMSO或甘油能夠提高多重擴增效率和敏感性,得到更多的擴增產(chǎn)物和減少非特異擴增。但是這些輔助劑可能會在另一方面干擾實驗效果,因為它對各基因位點擴增效率的影響不同50ml/L的DMsO可能會提高某一位點的擴增效率,降低另一位點擴增產(chǎn)物的數(shù)量,而對某些位點則根本不產(chǎn)生影響;同理,DMSO可能抑制也可能是促進非特異性擴增。因而使用這些輔助劑的效果需要在每個具體的反應體系中加以驗證。加入適量的BSA(如L.0g/L)能顯著提高多重PCR擴增效率。有時候BSA效果要比DMSO和甘油好,但它的作用同樣也需要實驗的驗證

有些研究人員建議使用濃度范圍為5%~10%體積分數(shù)的DMSO和甘油來改善擴增的效率和特異性,但在多重反應中,DMSO的使用會出現(xiàn)矛盾的結(jié)果。因此,DMSO和甘油的調(diào)節(jié)對實驗結(jié)果的影響要根據(jù)具體的實驗來摸索。

2.反應條件的優(yōu)化

由于在一個多重PCR反應體系中有多對引物,而且擴增的模板片段長度也不盡相同,所以各對引物的擴增效率和擴增速度也不相同。由于多重PCR反應總是遵循較小片段優(yōu)先擴增的原則,各對引物所要求最佳PCR條件也不盡相同(設計多對引物進行多重PCR時,應使各引物所需PCR擴增條件盡可能一致),因此在選擇多重PCR擴增條件(尤其是退火溫度和時間)時應盡量選擇有利于較大片段擴增的條件

(1)退火時間和溫度在循環(huán)參數(shù)中,影響多重PCR擴增效率的主要因素是復性溫度和延伸時間。復性溫度的設置策略與單個PCR相似。先計算引物的熔解溫度(Tm),在此基礎上推算復性溫度T。(T=T。-5)。然后用“逐步引人法”確定多重PCR的最佳T,即每增加一對引物,就根據(jù)擴增的結(jié)果調(diào)整復性溫度,直至每一種被擴增的基因片段都獲得滿意的效果。延伸時間是影響擴增產(chǎn)量的重要因素。隨著擴增的基因座數(shù)目的增加,延伸時間也應延長。在最佳的Mg2+和dNTP濃度范圍內(nèi)通過延長延伸時間來提高擴增產(chǎn)量,比單純增加Mg2+和dNTP濃度更為有效。

退火時間對擴增效率的影響遠遠小于退火溫度的影響,將退火溫度降低4~6℃對于在多重PCR中擴增出同樣的基因是必需的。多重反應中并發(fā)的其它基因的特異擴增會消除非特異擴增的影響,同樣,擴增效率高的基因會使擴增效率低的基因的擴增產(chǎn)量降低

(2)延伸溫度高的延伸溫度會減少某些基因的擴增,即使用長的退火時間和延伸時間也可能無法消除這種影響。

(3)延伸時間在多重PCR中,由于同時擴增多個基因,酶和dNTP的缺乏就成為限制因素,就需要更多的時間來完成所有產(chǎn)物的合成。多重PCR中增加延伸時間,可以增加較長PCR產(chǎn)物的量。也有實驗表明,當延伸時間延長時,所有基因的PCR產(chǎn)物量都增加了

4)PCR循環(huán)數(shù)PCR產(chǎn)物量增加最明顯的是在25個循環(huán)附近。通常對于一個反應,2830個循環(huán)就足夠了,增加至60個循環(huán)對產(chǎn)物量無明顯影響

總之,多重PCR反應條件的設置是一個棘手的問題,也是多重PCR成功的保證。一般策略是首先進行單個PCR反應,分別設定各引物對應的條件;然后,依次增加引物對,不斷調(diào)整反應條件直至最后保證所有的引物對都能在同一條件下擴增出目的條帶。

五、常見問題的解決

針對多重PCR中的常見問題,可以通過改變影響PCR擴增效果的因素來解決

1.若所有產(chǎn)物條帶都很弱

①增加延伸時間;

②降低延伸溫度至62~68℃;

③逐步降低退火溫度;

④調(diào)整 Taq DNA聚合酶的濃度;

⑤同時應用以上4種策略。

2.若短片段產(chǎn)物條帶較弱

①緩沖液濃度從1×增加至1.5×或2×;

②降低退火或延伸溫度;

③增加弱條帶相對應的引物量;

④同時應用以上3種策略。

3.若長片段產(chǎn)物條帶較弱

①增加延伸時間;

②增加退火和/或延伸溫度

③增加弱條帶相對應的引物濃度;

④降低緩沖液濃度至0.7×~0.8×,同時保持MgCl2濃度1.5~2mmol/1L不變;

⑤同時應用以上4種策略

4.若出現(xiàn)非特異產(chǎn)物

①若非特異產(chǎn)物是長片段,增加緩沖液濃度至1.4×~2.0×;

②若是短片段,降低緩沖液濃度至0.7×~0.9×;

③逐漸增加退火溫度

④減少模板和聚合酶的用量;

⑤增加Mg2至3mmol/L、6mmol/L、9mmol/L、12mmol/L-,同時保持dNTP濃度恒定在200umol/L:

⑥同時應用以上5種策略

5.若以上方法都未見效,可以進行以下嘗試

①加入輔助劑BSA(0.1~0.8pg/p);

②加入輔助劑DMsO或甘油(5%,體積分數(shù));

③重新比對引物,確保引物之間不存在相互作用;

六、應用

(一)多重PCR在遺傳病診斷方面的應用

1.DMD和BMD的檢測

Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥( Duchenne muscular dystrophy,DMI)是一種很常見的人類遺傳病,為X性染色體隱性遺傳性肌肉變性疾病,50%的病例由基因缺失引起,大約每3500個男嬰就有一個發(fā)病,1/3的病例由新的突變所致,肌營養(yǎng)不良基因長200kb,至少有70個外顯子,被35個平均35kb的內(nèi)含子所間隔1。目前尚無有效治療的方法,因而高度準確的產(chǎn)前診斷和DMD陽性篩選是十分重要的。以往多用 Southern分析技術來診斷,但由于該基因由多達70個外顯子,至少需要7~9個cDNA克隆才能診斷,費用高、費時而難以常規(guī)開展。BMD是Becker型肌營養(yǎng)不良癥( Becker muscular dystrophy)的縮寫。BMD亦為X性染色體隱形遺傳性肌肉變性疾病。BMD的發(fā)病率為新生男嬰的三萬分之一。65%的BMD病例的原因是基因缺失。

Chamberlain等利用多重PCR技術對DMD進行了檢測,設計了6對外顯子引物。用1umol/L引物加10UTaq酶,延伸溫度為?2℃3min,25個循環(huán)。產(chǎn)物電泳后,如與正常對照的對應條帶相比有缺失或移位,即為異常。隨后該實驗室又將引物增加至9對,使至少80%的DMD基因缺失得到確定,能直接診斷50%以上的病例。 Hentemann等2設計了2對產(chǎn)物分別為140bp和73bp的引物,對42例病人檢測后,發(fā)現(xiàn)7例基因缺失并經(jīng) Southern雜交分析證實。Simard等報道用 Chamberlain的引物對DMD進行擴增,并對DNA模板處理進行了改進,用lm羊膜液離心后的細胞經(jīng)非離子去垢劑和蛋白酶K的PCR緩沖液裂解后直接PCR擴增,效果令人滿意。由于 DMD/BMD是等位基因,近來的文獻多同時檢測此兩種疾病。Begs等用多重PCR同時檢測肌營養(yǎng)不良基因的8個外顯子和啟動子,可使98%有基因缺失的DMD/BMD獲得診斷。 Covone等人用兩種方法對照研究了127例DMD/BMID2一種方法是用與 DMD CDNA相關的9種cDNA探針與HindⅢ消化的基因族DNA雜交,另一種方法是用9對DMD外顯子的引物進行多重PCR檢測,結(jié)果73例(57%)存在基因缺失,兩組方法結(jié)果相近。我國華西醫(yī)科大學的學者亦用 Chamberlain的9對引物對17例DMD/MD病例進行了檢測,結(jié)果8例(47%)發(fā)現(xiàn)基因缺失,證明了針對西方人的引物序列同樣可以檢測中國病例。

2.用于其它遺傳病的檢測

Pici等人鵒對囊性纖維化( cystic fibrosis,CF)基因突變進行了篩選研究,用4對外顯子引物進行多重PCR擴增,然后用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,再進行垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳,檢查15例發(fā)現(xiàn)有3例發(fā)生了基因突變。Pior等設計了8對引物同時檢測DMD/BMD和CF,通過凝膠電泳篩選 DMD/ BMD缺失突變,并用等位基因特異的寡核苷酸雜交確定CF突變是否存在。實驗表明,可以通過多重PCR的方法從血斑中獲得足夠的DNA進行分子分析,可用于新生兒的篩選。 Pillers等人m用多重PCR和 Southern雜交方法研究了一位同時患AIED(Aland island eye disease)、甘油激酶缺乏(GKD)和DMD的病例,發(fā)現(xiàn)在DXS67(1 deoxy-D-xylulose5- phosphate synthase67)和DMD基因之間出現(xiàn)基因缺失。另外,還有用多重PCR方法篩查類固醇硫酯酶( steroid sulfatase,,srs)缺乏癥和診斷β地中海貧血患者的報道。

脊髓性肌萎縮癥( spinal muscular atrophy,SMA)是一種常染色體隱性遺傳神經(jīng)性肌肉疾病。SMA會造成位于腦底和脊髓的下級運動神經(jīng)元分裂,從而使其無法發(fā)出肌肉進行正常活動所依賴的化學及電信號。SMA主要影響患者的近端肌,即最靠近人體軀干部的肌肉?？刂莆?、腸和膀胱等器官運動的非隨意肌不會受到影響。各型都會對控制隨意肌運動的叫作運動神經(jīng)元的神經(jīng)細胞產(chǎn)生影響。最近的基因研究發(fā)現(xiàn),運動神經(jīng)元的死亡也許是因為缺少一種或幾種蛋白,或者是它們不能完全發(fā)揮其功能而導致的。 Simard等應用多重實時反轉(zhuǎn)錄PCR方法(muli Xplex real-time reverse transcriptase- PCR)對存活運動神經(jīng)元( survival motor neuron,SMN)的轉(zhuǎn)錄本進行定量,共檢測了42個潛伏期SMA病人的血標本,每個病人取三個時間點,發(fā)現(xiàn)SMN的表達在每個病人的不同時間點上的轉(zhuǎn)錄是穩(wěn)定的, SMN mRNA表達的實時定量檢測可以作為SMA臨床試驗的生物標志以作為SMA臨床試驗的生物標志

甘露糖結(jié)合素( mannose-binding lectin,MBu)是一種血清蛋白,能夠觸發(fā)補體激活,因此在先天性免疫中發(fā)揮重要作用。低水平的MBL會損傷病原微生物的調(diào)理作用,進而導致兒童的反復感染、免疫受損病人的嚴重感染以及自身免疫疾病。MHBL的編碼基因位于人類10q11.2~q21染色體,包括四個外顯子,血清中MBL水平受其啟動子多態(tài)性和MB2基因第一個外顯子突變的影響。目前應用的MBL基因分型方法主要有以下幾種:PCR限制酶切分析、序列特異寡核苷酸探針雜交( sequence-specific oligonucleotide probes,SsOP)、放大受阻突變體系( amplification refractory mutation system,ARMs)、ARMS聯(lián)合SSOP、異源雙鏈分析( heteroduplex analysis)、實時PCR以及應用小溝結(jié)合DNA探針的5端核酸酶分析。 Helena0等建立了種快速、高效的多重PCR方法對MBL2基因進行分型,并且將捷克人作為斯拉夫人的代表樣本,應用此方法研究了MBI2的等位基因頻率。共分析了359個不相關捷克人的MBL2基因,最終得出LYD單元型在斯拉夫人的祖先中比其它高加索人更常見,同時也證明了多重PCR是一種比傳統(tǒng)PCR方法更快速、簡便、省時省力的MBI2分型方法。

根據(jù)當前不育領域的研究,大約10%~15%的夫婦存在不育的問題,而在所有的不育個體中,男性不育大約占50%,其中40%~50%存在精子缺陷,如少精癥和無精癥。人類Y染色體的長臂對于精子的產(chǎn)生是必需的。在三個不同區(qū)域的缺失會導致嚴重的精子缺陷,包括非閉塞的無精子癥和精子減少癥。這些區(qū)域被稱為無精子癥因子( azoospermia factor,AZF),三個分離的非重疊區(qū)被定義為AzFa、AZFb、AZFc,與產(chǎn)生人類損傷的精子有關。近來的研究證明Yq染色體的微缺失會遺傳給其兒子。Yeom等應用多重PCR擴增6個位點,包括Y染色體的性別決定區(qū)( sex-determining region on the Y chromosome,SRY)作為陽性對照,無精子癥因子區(qū)域的5個序列標簽位點( sequence-tagged site,Srs),其中模板是從不育男性血液中提取的基因組DNA。本研究中的引物為Cy3標記,PCR產(chǎn)物可以與固定的探針雜交,提供了一種敏感、高通量檢測Y染色體缺失的方法,也是一種男性不育篩選的新方法。

(二)著床前胚胎遺傳學診斷( preimplantation genetic diagnosis,PGD)

PGD產(chǎn)生于10多年前,主要目的是識別基因突變或染色體錯誤引起的遺傳性疾病。臨床上最早是用來檢測夫妻X隱形連鎖疾病,隨后應用于不同的患者來達到優(yōu)生優(yōu)育的目的,主要包括:單基因病攜帶者,無論顯性或隱性、常染色體或X連鎖;染色體結(jié)構(gòu)異常攜帶者,包括易位、翻轉(zhuǎn)、缺失、插入等;避免高齡產(chǎn)婦后代染色體異常;輔助生殖治療反復植入失敗的夫婦反復出現(xiàn)不明原因流產(chǎn)的夫婦。當前PGD已經(jīng)成為產(chǎn)前診斷( prenatal diagnosis)的一種替代方法。

對于單基因缺陷患者,可以用多重PCR同時擴增多個位點,選擇那些位于相同染色體或者臨近致病基因的多態(tài)性標志位點進行擴增能夠有效診斷突變位點和多態(tài)性等位基因,可以同時分析多個診斷位點,并且減少錯誤診斷的概率。另外,還可以擴增高變的指紋位點,指示DNA模板是否被污染

囊性纖維化病( cystic fibrosis,CF)是一種首次成功應用單細胞植入前基因診斷的單基因缺陷性疾病。CF的突變譜差別很大,因此,發(fā)展一種突變特異的PGD方法是行不通的。文獻[35]建立了一種針對CF通用的多重PCR方法,用于胚胎的遺傳學診斷。本研究應用了CF跨膜調(diào)控子( cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)兩側(cè)的4個緊密連鎖高多態(tài)性重復標識:D7S523、D7S486、DS480和D7S90。共檢測了100個白細胞和50個卵裂球,其中99%6獲得了多重PCR結(jié)果,總體等位基因遺失( allelic drop out,ADO)頻率從2%~5%不等。確認ADO以及額外等位基因存在后,95%的多重PCR結(jié)果可以用來建立基因型標記?；诟改傅幕蛐?考慮到由于變異參數(shù)(5%、ADO(0~2%)和單重組(1.1%~3%)造成的胚胎傳送丟失,大約90%的胚胎能夠應用單個卵裂球進行可靠的PGD基因分型。錯誤診斷的概率與已知的兩側(cè)標識雙重組概率相當,小于0.05%。因此,這種多態(tài)性和多等位基因標識系統(tǒng)是一種可靠的、可替代直接突變胚胎遺傳學診斷的方法。

(三)在遺傳修飾生物( genetically modified organisms,GMO)中的應用

近年來可見應用多重PCR技術在轉(zhuǎn)基因成分定性和定量檢測的報道。陳文炳等用多重PCR方法在反應體系中加入13對引物同時檢測轉(zhuǎn)基因矮牽牛與陽性對照質(zhì)粒中的1~3個外源基因,包括花榔菜花葉病毒( cauliflower mosaic virus, CaMV)35S啟動子、根瘤農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因終止子(NOS)、大腸桿菌K12菌株新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NptⅡ)編碼基因。結(jié)果表明,多重PCR不但可以提高檢測效率、降低檢測成本,還可以有效防止假陽性結(jié)果的出現(xiàn)

四)基因重排

免疫球蛋白( immunoglobulin,Ig)和T細胞受體( T cell receptor,TCR)位點包含很多不同的V、D、J基因片段,參與早期白細胞分化的重排過程。VDJ片段重排由重組酶復合體介導,其中RAG1和RAG2蛋白通過識別、切割DNA重組信號序列( recombination signal sequences,RSs)發(fā)揮重要作用,RSS位于V基因下游、D基因兩端和J基因上游。不合適的RSS會降低甚至完全阻止重排。 van dongen等成功建立了一種多重PCR方法并將其標準化,能夠檢測同源細胞重排免疫球蛋白和T細胞受體基因、染色體畸變t(11;14)和t(14;18)。在18個多重FCR反應中,可以使用107對不同的引物進行擴增。14個Ig/TCR和4個BCL/BCL2多重反應體系證明了多重PCR反應完全適合淋巴增生缺陷的克隆研究,并且具有較高的敏感性。特別是在疑似B細胞增殖中與IGH和IGK聯(lián)合應用,疑似T細胞增殖中與TCRB和TCRG聯(lián)合應用具有極高的克隆檢出率

(五)抗性基因檢測

抗生素的廣泛使用導致具有耐藥性微生物的增多,比如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌( methi-cillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、萬古霉素抗性腸球菌( vancomycin resistant enterococcl)和多重耐藥結(jié)核分枝桿菌( multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis)等。這些病原的快速檢測及對應的抗生素抗性快速檢測對于隔離病人和阻止疾病的進一步蔓延是很重要的。多重PCR方法能夠?qū)@些抗生素抗性基因進行同時檢測,節(jié)省時間,具有較高的敏感性和特異性。

Strohmenger等應用多重PCR方法同時檢測金黃色葡萄球菌的9種耐藥基因,包括mecA、aacA~anhD、tetK、tetM、emA、emC、wtA、wtB和wC,并且在反應中加入另外對引物,擴增金黃色葡萄球菌的16 SrRNA作為陽性對照。通過對分離的3株金黃色葡萄球菌進行檢測,多重PCR結(jié)果與肉湯微量稀釋實驗得到的抗性表型一致,證明了多重FCR是一種識別抗生素抗性的快速、簡便、精確方法,并且可以用于臨床診斷、流行病學研究中用于監(jiān)測抗性基因的傳播還可用多重PCR方法同時檢測質(zhì)粒介導的喹諾酮抗性基因qmA、qrB和qnrS,并用來篩選科威特分離的64株產(chǎn)超廣譜內(nèi)酰胺酶( expanded- spectrum beta-lactamase,ESBL)的腸細菌。