等溫擴增是PCR的補充還是代替？？來看看他們的優(yōu)劣勢！

X_DaDa 2020-07-24

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近年來，隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，基于核酸檢測的診斷方法已大量建立并廣泛應用于人類疾病的實驗室檢測中，等溫擴增技術便是其中一種，與其他的核酸擴增技術相比，等溫擴增有快速、高效、特異的優(yōu)點且無需專用的設備，所以它一經出現就被許多學者認為是一種有可能與PCR媲美的檢測方法。

相信以等溫核酸擴增技術為基礎的診斷儀器和試劑盒的開發(fā)和應用會是未來一，二十年的方向。本文總結了目前常見的等溫核酸擴增技術：LAMP、NERA、NASBA、RCA、HDA、RPA和ERA。同時對PCR和幾種恒溫核酸擴增技術進行了比較。

為了更好地有選擇地開發(fā)利用這方面技術，現就這些等溫擴增技術的原理、特點及應用進行簡要總結。

?聚合酶鏈式反應（PCR）

聚合酶鏈式反應（PCR）是利用耐高溫的DNA聚合酶（Taq 酶），將模板DNA，引物，脫氧核苷三磷酸（dNTP）和緩沖液等在不同溫度間循環(huán)，從而達到雙鏈DNA分離，引物粘合到模板上的互補區(qū)間，最后在DNA聚合酶作用下脫氧核苷三磷酸逐個添加到新合成的DNA鏈上的過程。

PCR是利用DNA 在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

環(huán)介導等溫擴增 (LAMP )

環(huán)介導等溫擴增其擴增原理是基于DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈，在此前提下利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下，以外側引物區(qū)段的3`末端末端為起點，與模板DNA互補序列配對，啟動鏈置換DNA合成。

LAMP的優(yōu)勢：

（1）擴增效率高，能夠在1h內有效的擴增1-10拷貝的目的基因，擴增效率是普通PCR的10倍-100倍

（2）反應時間短，特異性強，不需要特殊的設備

LAMP的劣勢：

（1）對引物的要求特別高

（2）擴增產物不能用于克隆測序，只能用于判斷

（3）由于其敏感性強，特別容易形成氣溶膠，造成假陽性影響檢測結果

相關產品及應用

LAMP在應用于檢測各種病原體的同時，現已逐步用于包括DNA病毒、RNA病毒、細菌和寄生蟲等的定性和定量檢測，如對新冠病毒、HIV病毒、流感病毒、埃博拉病、偽狂犬病病毒、口蹄疫病毒、副溶血弧菌和日本血吸蟲偽蚴等的檢測，也可用于轉基因食品的檢測及動物胚胎性別鑒別等。

切口酶恒溫擴增技術（NEAR）

切刻內切酶（NEAR）恒溫擴增是目前相關研究最少的一種恒溫核酸擴增技術。它是在2008年由Ionian科技公司的研究人員開發(fā)并申請專利的（Brain等2009）。Ionian是加州的初創(chuàng)公司，成立于2000年，在2010年被Alere收購。而后Alere在2017年被雅培收購，NEAR成為雅培的專利。

NEAR是一種鏈置換放大技術，其原理是在核酸切刻內切酶切刻形成的裂口處，通過聚合酶的作用以dNTPs為原料從裂口處的3’端聚合延伸，置換出等位的DNA鏈，由此又形成了新的完整的含有切刻酶識別位點的DNA序列。這條雙鏈再次被核酸切刻內切酶識別切割，進而開始“聚合-切刻”的循環(huán)，產生大量被置換下來的DNA單鏈，形成指數級擴增。

NERA的優(yōu)勢：

（1）速度快（最快5分鐘可以得到陽性結果）

（2）靈敏度高（初始只需要數百個病毒拷貝）

（3）區(qū)別于引物設計較復雜的LAMP技術，NEAR技術反應形式多樣，可滿足不同的擴增需求

（4）反應穩(wěn)定性好

NEAR的劣勢：

（1）短序列的設計存在高假陽性的可能

（2）反應機制復雜、產物產量易受擴增模板限制，使得后期擴增從指數增長變?yōu)榫€性增長

（3） NEAR恒溫擴增技術的特異性與靈敏度依賴于分子信標引物和Nicking酶，分子信標引物的設計難度大，Nicking酶與其他恒溫擴增酶一般都普遍比傳統(tǒng)的實時熒光PCR酶要貴，故在檢測成本和應用范圍等方面，NEAR恒溫擴增技術遜于qPCR。

相關產品及應用

被雅培收購的Alere是唯一一家使用NEAR技術開發(fā)人類疾病診斷試劑盒及儀器的公司。如圖所示，Alere的Influenza A和B的檢測試劑盒最快5min檢出陽性，7min陽性檢出率95%，13min可以確定陰性。另一個關于StrepA的檢測試劑盒最快2min檢出陽性，3min陽性檢出率99%，6min可以確定陰性。這是關于Flu和StrepA最快的分子的檢測試劑盒，但ID NOW儀器的通量很小，一次只能檢測一個樣本。目前的新冠疫情下，實驗室的大量檢測仍然需要依賴傳統(tǒng)高通量qPCR的批量檢測，ID NOW無法對于大量樣本的檢測能力提升帶來較大的幫助。而ID NOW屬于POCT范疇，在醫(yī)生辦公室、緊急護理診所和醫(yī)院急診科等廣泛的醫(yī)療場景中都可以進行檢測，可以起到一定的市場補充作用。

依賴核酸序列的擴增 (NASBA)

依賴核酸序列的擴增技術 (NASBA)是在PCR基礎上發(fā)展起來的一種新技術，是由1對帶有T7啟動子序列的引物引導的連續(xù)、等溫、基于酶反應的核酸擴增技術，反應在41℃進行，可以在2h左右將模板RNA擴增約109倍，比常規(guī)PCR法高1000倍，不需特殊的儀器。

該技術一出現就被用于疾病的快速診斷和病人血清中HIV-1的定量檢測。盡管RNA的擴增也可以使用反轉錄PCR技術（通過反轉錄形成單鏈DNA模板),NASBA相比則有自己的優(yōu)勢：可以在相對恒溫的條件下進行（一般恒溫為41攝氏度）。該技術用于醫(yī)學診斷，相對傳統(tǒng)的PCR技術更為穩(wěn)定，準確。

NASBA的優(yōu)勢：

（1）它的引物上帶有T7啟動子序列，而外來雙鏈DNA無T7啟動子序列，不可能被擴增，因此該技術具有較高的特異性和靈敏度。

（2）NASBA將反轉錄過程直接合并到擴增反應中，縮短了反應時間。

NASBA的劣勢：

（1）反應成分比較復雜

（2）需要3種酶使得反應成本較高

（3）對DNA病毒的檢測上NASBA就顯得不是那么適合

相關產品及應用

NASBA作為一項檢測技術是十分成熟的，并且已經在國際上受到基礎科學和應用科學研究領域的一致認可。目前主要用于RNA的擴增、檢測及測序，特別適用于擴增單鏈RNA，也可用于擴增DNA，已成功地應用于病毒、細菌、寄生蟲和細胞因子等的檢測。在動物醫(yī)學方面，已經廣泛用于禽流感病毒、新城疫病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒和產單核細胞李斯特菌的檢測和研究中。Biomeriex公司的恒溫擴增產品便是采用這種方法設計的。

滾環(huán)擴增技術 (RCA)

1998 年建立的滾環(huán)擴增 (RCA) 是模擬自然界微生物環(huán)狀 DNA 的滾環(huán)復制過程，發(fā)展起來的一種放大信號和靶核酸相結合的檢測方法。在具有鏈置換活性的 DNA 聚合酶作用下由一條引物與環(huán)形 DNA 模板的鏈置換合成，實現環(huán)狀 DNA 模板的體外等溫線性擴增?？煞譃榫€性擴增 (單引物 RCA)、指數擴增、多引物擴增和信號擴增RCA。

這種方法不僅可以直接擴增DNA和RNA，還可以實現對靶核酸的信號放大，靈敏度達到一個拷貝的核酸分子，因此在核酸檢測中具有很大的應用價值和潛力。

RCA的優(yōu)勢：

（1）高靈敏度，RCA有很強的擴增能力，線性RCA的效率可達到105倍，而指數RCA的效率可達到109倍，具有檢測單拷貝的潛力。

（2）高序列特異性，可以區(qū)分單一位點的不同模式

（3）擴增產物經過磷酸化處理后可直接用來測序

（4）高通量，RCA可以在靶目標上形成閉合的環(huán)狀序列，確保RCA產生的信號集中在一點，從而實現原位擴增和載片擴增。

RCA的不足：

（1）瑣式探針常接近100bp,合成費用較高。

（2）信號檢測時存在背景干擾問題

相關產品及應用

RAC在核酸測序、單核苷酸多態(tài)性基因分型及細胞原位檢測分析、DNA芯片、蛋白質芯片分析等方面都有著廣泛的應用前景。目前Qiagen公司和GE Healthcare公司已經用φ29 DNA聚合酶和RCA發(fā)展了TempliPhi DNA測序模板擴增試劑盒，可以產生高質量的模板用于DNA測序。在腫瘤的早期核酸檢測和監(jiān)測分析方面也是一個很有潛力的分析工具。

依賴解旋酶 DNA等溫擴增技術 (HDA)

依賴解旋酶 DNA 等溫擴增技術 (HDA) 是美國NEB 公司于 2004 年發(fā)明的一種新型核酸等溫擴增技術。該技術模擬體內 DNA 復制的自然過程，利用解旋酶在恒溫下解開 DNA 雙鏈，再由 DNA 單鏈結合蛋白穩(wěn)定已解開的單鏈為引物提供模板，然后在 DNA 聚合酶的作用下合成互補的雙鏈，繼而不斷重復上述循環(huán)擴增過程，最終實現靶序列的指數式增長。

HDA優(yōu)勢：

（1）簡單有效，操作簡便

（2）不需要昂貴的PCR儀，較細菌學、免疫學和PCR方法更適于在基層實驗室推廣應用。

HDA的不足：

HDA的研究者較少，發(fā)展還不夠成熟。

相關產品及應用

研究表明，HDA能夠擴增微生物基因組DNA、病原菌DNA、質粒DNA和cDNA等。目前已有HDA應用于腹瀉性梭狀芽孢桿菌方面的報道。Quidel Corporation的恒溫擴增產品便是采用HDA原理設計的。

重組酶聚合酶擴增(RPA)

RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37°C左右。

常規(guī)PCR必須經過變性、退火、延伸三個步驟，而PCR儀本質上就是一個控制溫度升降的設備。RPA反應的zui適溫度在37℃-42℃之間，無需變性，在常溫下即可進行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設備，RPA可以真正實現便攜式的快速核酸檢測。

RPA的優(yōu)點：

①快速檢測，在 37-42°C 這一通常最適宜的反應溫度下，只需少量核酸分子即可在 3-10 分鐘（通常）內擴增至可檢出水平，但這將取決于靶標大小。在大部分情況下，只需要一個人即可在半小時內采集樣本、制備樣本、運行檢測并取得結果，并且無需專業(yè)培訓；

②支持在同一個管中同時進行多個擴增反應。不過，多重化的引物組合需要精心設計，以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應的引物總量（nmol）最好不要超標太多。如果在一個反應中使用兩個以上的擴增引物，就應該控制不同引物的量。另外，檢測多個擴增事件的探針、設備以及熒光物質的兼容性都需要提前考慮；

③可定量。擴增子達到可檢出水平的時間，依賴于反應起始時的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增就越快達到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實驗安排，確保對照反應是同時開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時間進行控制。因為鎂離子一旦進入體系，RPA反應就會開始。此外，較慢的擴增過程有助于更精確的定量。我們可以通過調整反應條件或引物設計來減慢RPA的反應速度；

④25-42℃常溫反應，無須熱循環(huán)，擺脫任何儀器束縛；

⑤可進行熒光終點分析；

⑥引物設計簡單，PCR引物設計軟件可進行，只要將長度增加到30bp以上，更能保證其特異性；

⑦靈敏度高，能將痕量的核酸模板（1-10拷貝）擴增到可以檢出的水平；

⑧特異性高，與qPCR無差異，特別適合微量樣品的檢測。

RPA的缺點：

①瓊脂糖凝膠電泳成像在檢測前需要產物純化；

②沒有PCR的熱循環(huán)來避免引物之間的結合，故恒定溫度下反應難以避免部分非特異性擴增。

相關產品及應用

目前，RPA在國際上已有3個公司分別各有1項類似技術，其中主要是被雅培收購的TwistDx的核酸擴增產品。以RPA為基礎的TwistAmp? 核酸擴增產品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農業(yè)等領域。

酶促重組等溫擴增技術（ERA）

酶促重組等溫擴增技術（ERA）是wo'm蘇州先達基因科技有限公司的（www.），具有全球自主知識產權的一種恒溫的核酸快速擴增技術，主要依賴能結合單鏈寡核苷酸引物的重組酶、單鏈DNA結合蛋白和DNA聚合酶。在溫度為37℃~42℃的環(huán)境下，該重組酶可與引物DNA緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補序列時，在單鏈DNA結合蛋白的幫助下，打開模板 DNA的雙鏈結構，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈，擴增產物以指數級增長。