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1、Q：要做胃粘膜組織的DNA含量及倍體檢查，但取材后要等幾個星期才會做流式細(xì)胞術(shù)檢查，請問：胃組織要怎樣保存好呢？用低溫保存，還是用乙醇固定？或者固定后再低溫下保存？
A：我做過乳腺細(xì)胞的DNA含量測定，取得組織以后，先處理成單細(xì)胞懸液，然后再加70%冰乙醇固定，要保證冰乙醇的最終濃度為50%，這樣固定的細(xì)胞懸液可以至少保存12小時，最多可保存一個月，上機檢測前再加PI綜合染液。我就是這樣做的，保存了將近三個星期，結(jié)果還可以，變異系數(shù)為5%.
2、實驗中想用PI分析細(xì)胞周期及凋亡率，請教幾個問題：
Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配嗎？
A：RNaseA用PBS配制沒有問題，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
Q：（2）測細(xì)胞周期和凋亡率時都要用RNAs酶，可以一起檢測嗎？
A：用流式細(xì)胞儀測定時細(xì)胞周期和凋亡率是同時測定的，不用擔(dān)心。
Q：（3）Triton－x－100是固定劑吧，用了70％的冷乙醇（是4℃嗎？），是不是就不用Triton－x－100固定了？
A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定劑，可以用75％的乙醇于-20度固定。
Q：（4）還要設(shè)什么內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)（5％雞紅細(xì)胞）嗎？
A：對照肯定是需要的，這個根據(jù)自己的需要進(jìn)行設(shè)置。
Q：（5）不用試劑盒行不行??？
A：完全可以不用試劑盒。
以下提供一個自己的實驗步驟供參考：
（1）200×g離心10min收集細(xì)胞；
（2）棄去上清，PBS漂洗一次，將細(xì)胞重懸于預(yù)冷的80%乙醇中，-20°C固定24h以上；
（3）進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測前，200×g離心10min收集固定后的細(xì)胞；
（4）PBS洗滌一次，200×g離心10min收集細(xì)胞；
（5）將細(xì)胞重懸于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室溫孵育30min；
（6）將經(jīng)PI染色和RNase A消化后的細(xì)胞懸液用300目的尼龍膜過濾后即可利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分布和凋亡細(xì)胞定量的分析。
3、Q：流式檢測細(xì)胞周期時加RNA酶所需的溫度？
A：其實有關(guān)RNA酶在凋亡檢測制樣過程中使用的必要性問題尚有人持不同意見，該觀點的人認(rèn)為RNA酶在環(huán)境中無所不在，常規(guī)制樣過程中所接觸的試劑和環(huán)境中的RNA酶已足以降解樣品中的RNA，所以為了簡便實驗操作，也有人不加RNA酶或如你所參考的方法將其與PI染液一起使用。不過經(jīng)典的方法還是“先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI 4度孵育30min”。
至于染色時使用4度，是因為低溫可減弱分子運動，增強熒光染料結(jié)合的穩(wěn)定性和減少可能的熒光損耗。上流式前細(xì)胞用75％乙醇固定行嗎？
4、Q：我養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，測周期?？吹教诱f70％乙醇必須用PBS和乙醇配，用水配細(xì)胞會碎裂，有帖子說PBS和乙醇配會出現(xiàn)絮狀物。上流式前細(xì)胞用75％乙醇固定，就用買來的現(xiàn)成的瓶裝75％乙醇，行嗎？必須那么嚴(yán)格嗎？
A：先用冷PBS懸浮細(xì)胞，大約1-2ml，充分懸浮，使細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞。之后緩慢加入無水乙醇，終濃度為70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇會導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)聚的現(xiàn)象，很難重懸成單細(xì)胞。乙醇固定之后沒有細(xì)胞沉淀。
5、Q：我要做流式分析細(xì)胞周期，我大概收集了10的6次方細(xì)胞，但細(xì)胞在乙醇固定之后，還看到有細(xì)胞沉淀的，但PBS洗滌兩次之后，就基本沒什么細(xì)胞沉淀了，上機發(fā)現(xiàn)就發(fā)現(xiàn)不了細(xì)胞了。這是怎么回事啊？怎么解決這個問題啊？
A：很可能是洗細(xì)胞的過程中丟失了，解決辦法有：
（1）盡量采用尖底的離心管和水平離心機
（2）離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒；吸上清時最好殘留1mm左右的水膜，不要吸完。
（3）離心的轉(zhuǎn)速或時間可稍微增加一點兒
（4）每次加抗體時，吸頭最好不要接觸液面；混勻時最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細(xì)胞。
6、Q：流式細(xì)胞PI單染中為什么用RNAse？
A：在測細(xì)胞周期時，因為已經(jīng)在細(xì)胞膜打孔了，PI很容易透過細(xì)胞膜和DNA結(jié)合，但RNA也是核酸，也會被染色，為避免干擾染色前需用RNAse降解RNA。這樣PI只染DNA，能精確以熒光強度反映DNA的含量。
7、最近做了幾次流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)有幾個問題：
Q：（1）我所用的是腫瘤細(xì)胞， 但是同樣的細(xì)胞類型，同樣的處理因素，雖然兩次獨立實驗作出來的結(jié)果總體趨勢都是在某種藥物干預(yù)后，S期比例下降，但兩次結(jié)果S期比列具體數(shù)值相差很大，同樣，G2/M期在干預(yù)前后無變化，但兩次獨立實驗數(shù)值卻相差很大，那么可以說，做流式是每次細(xì)胞狀態(tài)不一樣，結(jié)果也會相差很大，是不是細(xì)胞密度會對結(jié)果產(chǎn)生很大影響，那么如果細(xì)胞密度在60-70%時和細(xì)胞已經(jīng)長滿（90%以上）也會導(dǎo)致各期數(shù)值的差異？如果是這樣，長滿的細(xì)胞（不再增殖）是表現(xiàn)的G1或S或G2/M上升還是下降？
A：應(yīng)該是兩批細(xì)胞在實驗時本身所出周期不同所致，可以在實驗前進(jìn)行細(xì)胞的同步化處理，減少批間差異。實驗細(xì)胞應(yīng)處于對數(shù)生長期，而不能是完全長滿，一般在50～80％比較好。自然狀態(tài)下，不增殖的細(xì)胞應(yīng)該處于G0/G1期。
Q：（2）其次就是結(jié)果分析，細(xì)胞周期特異性藥物如抗代謝藥作用后主要表現(xiàn)的是S期比例下降，細(xì)胞被阻滯在G1期，自然G1期比列升高。而有些植物藥如長春堿類或紫杉醇類，主要作用于M期，那么結(jié)果是否表現(xiàn)為G2期比例升高，還是S期也相應(yīng)升高？還有就是細(xì)胞經(jīng)抗腫瘤藥物作用后反而出現(xiàn)的S期升高，可能是那些原因，如何分析？
A：周期特異性藥物阻滯哪一期，哪一期就升高，不會使其它階段細(xì)胞增多。
8、Q：我用流式做胃癌細(xì)胞周期分析時不出現(xiàn)S、G2/M峰？什么原因呢？自己分析可能為PI沒染上色，是不是染色時間太短呢？
A：你用了多少PI染色多久呢？一般來說30分鐘夠了.我覺得可能是打孔或者rna沒有處理掉沒有成功，染色時間并不是關(guān)鍵。
9、Q：做流式細(xì)胞時，PI 染色，PI的濃度應(yīng)該是多少?還有就是400目的篩網(wǎng)是什么？不用可以嗎？謝謝。
A：100ug/ml，一般用400目的篩網(wǎng)是用來將粘在一起的細(xì)胞團(tuán)濾掉的，否則會出現(xiàn)人為的多倍體干擾，分析的時候需要的是單個的細(xì)胞，不過如果經(jīng)驗豐富也可以gate掉的。如果你沒有條件，建議在染色之前將細(xì)胞彈的很散，再進(jìn)行染色
10、Q：流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期樣品怎樣準(zhǔn)備？
A：給你介紹一下我的實驗方法，我做的是周期檢測，要做平行樣，六孔板做的。
（1）收集先棄液，將你要實驗（你已經(jīng)處理好的）的細(xì)胞PBS洗兩次，加胰酶消化（注意：如果要是加藥物或者其他處理過的細(xì)胞，棄液和PBS洗液均收集）；
（2）加培養(yǎng)基終止消化，打勻在分別收到各自離心管中（注意，收集過程中及后續(xù)過程中槍頭不要混用，要不平行樣也就沒意思了）；
（3）離心，1000rpm，5min棄液；
（4）4度PBS（1到2ml）洗兩次，離心，1000rpm，5min棄液；
（5）加入負(fù)20度70%酒精（1到2ml）打勻，固定，至少半個小時以上，（不做的話，可放入4度冰箱保存2-3周問題不大）；
（6）離心，1000rpm，5min棄酒精；
（7）4度PBS（1到2ml）洗，離心1000rpm，5min棄液；
（8）4度PBS（1到2ml）洗，打勻后，將細(xì)胞懸液用100 目的紗布直接過濾到流式檢測管中；
（9）離心，1000rpm，5min棄液；
（10）加PI染液染色（濃度為50ug/ml），PBS32.4ml ，PI 2.5mg，Rnase 0.5mg，（Triton-X-100 0.25ml，枸櫞酸鈉50mg，這兩我沒加也效果不錯）加PBS至50ml，4度避光保存數(shù)月。106細(xì)胞中加入1ml PI染液， 振蕩器振勻，避光染色至少30 min， 上機檢測；
（11）統(tǒng)計分析。
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