一、分離純化的基本原理

研究基因的表達(dá)和調(diào)控時(shí)常常要從組織中分離和純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫(kù)，RT-PCR和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。 

二、需自備的試劑和材料

無(wú)水乙醇、氯仿、1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）

三、準(zhǔn)備工作

RNase酶非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時(shí)失活，但限制因素去除后有迅速?gòu)?fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須戴手套。

   RNase的又一污染源是取液器，根據(jù)取液器制造商的要求對(duì)取液器進(jìn)行處理。一般情況下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一種RNase抑制劑)配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，基本達(dá)到要求。取RNase-free的物品時(shí)必須戴手套。

      1、 塑料制品的處理

      盡可能使用無(wú)菌，一次性塑料制品，已標(biāo)明RNase-Free的塑料制品，如沒(méi)有開封使用過(guò)通常沒(méi)有必要再次處理。對(duì)于國(guó)產(chǎn)塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理步驟如下： 

1）在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注意：DEPC為劇毒物，活性很強(qiáng)，小心在通風(fēng)柜中使用。

2）處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。

3）在通風(fēng)柜中室溫處理過(guò)夜。

4）將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水處理過(guò)的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。

5）烘箱用合適的溫度烘拷至干燥。置于干凈處備用。

    2、 璃玻和金屬物品

250°C高壓滅菌烘烤3小時(shí)以上。

四、從組織中提取總RNA步驟

1)液氮研磨：組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/ml Trizol加入Trizol，轉(zhuǎn)入離心管進(jìn)行第2步操作。

（液氮既能使各種組織成分不易被破壞或降解,又能使組織變硬,脆性增加易于磨碎。終止細(xì)胞內(nèi)外一切生物反應(yīng)，防止RNA酶的降解反應(yīng)）

2) 勻漿：組織樣品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。另外，組織體積不能超過(guò)Trizol體積的10%，否則勻漿效果會(huì)不好，用電動(dòng)勻漿器充分勻漿約需1-2分鐘。

3) 加Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。注：此時(shí)可放入-70℃長(zhǎng)期保持。

4) 12,000rpm 離心5min，棄沉淀。

5) 按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。

（氯仿為有機(jī)溶劑，有效的使有機(jī)相和無(wú)機(jī)相迅速分離。有機(jī)相中主要是酚和蛋白結(jié)合，從而使得蛋白和RNA脫離，RNA進(jìn)入水相）

6) 4℃ 12,000g離心15min。

7) 吸取上層水相，至另一離心管中。注：千萬(wàn)不要吸取中間界面；若同時(shí)提取DNA和蛋白質(zhì)，則保留下層酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，則棄下層酚相。

8) 按0.5ml異丙醇/ml Trizol 加入異丙醇（沉淀RNA）混勻，室溫放置5-10min。

9) 4℃ 12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。

10) 按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇（沉淀RNA），溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。

11)  4℃8,000g離心5min，盡量棄上清。

12) 室溫晾干或真空干燥5-10min。注：RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。

13) 可用50ul H₂O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA樣品，55-60℃,5-10min。注：H₂O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。

（TE緩沖液由Tris和EDTA配制而成，主要用于溶解核酸，能穩(wěn)定儲(chǔ)存DNA和RNA。用于酶切反應(yīng)不能使用SDS）

14) 測(cè)O.D值定量RNA濃度。注：此方法提取RNA A₂₆₀/A₂₈₀值在1.6-1.8之間；

電泳檢測(cè)：1%瓊脂糖，1×TEA緩沖液，90V電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)觀察，分析結(jié)果。

注：組織過(guò)少，可酌情減少Trizol用量；組織用量過(guò)多，會(huì)引起DNA對(duì)RNA的污染；熱天提RNA，帶手套是必須的，手是RNase的主要來(lái)源； 

注明：本文整理自網(wǎng)絡(luò)