本通則適用于人用生物制品生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)及檢定用動(dòng)物細(xì)胞，包括具有細(xì)胞庫體系的細(xì)胞及原代細(xì)胞。細(xì)胞基質(zhì)系指可用于生物制品生產(chǎn)的所有動(dòng)物或人源的連續(xù)傳代細(xì)胞系、二倍體細(xì)胞株及原代細(xì)胞。
生產(chǎn)非重組制品所用的細(xì)胞基質(zhì)，系指來源于未經(jīng)修飾的用于制備其主細(xì)胞庫的細(xì)胞系/株和原代細(xì)胞。生產(chǎn)重組制品的細(xì)胞基質(zhì)，系指含所需序列的、從單個(gè)前體細(xì)胞克隆的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。生產(chǎn)雜交瘤制品的細(xì)胞基質(zhì)，系指通過親本骨髓瘤細(xì)胞系與另一親本細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞系。
一、對(duì)生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)總的要求
用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞系/株均須通過全面檢定，須具有如下相應(yīng)資料，并經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。
?。ㄒ唬┘?xì)胞系/株歷史資料
1. 細(xì)胞系/株來源資料
應(yīng)具有細(xì)胞系/株來源的相關(guān)資料，如細(xì)胞系/株制備機(jī)構(gòu)的名稱，細(xì)胞系/株來源的種屬、年齡、性別和健康狀況的資料。這些資料最好從細(xì)胞來源實(shí)驗(yàn)室獲得，也可引用正式發(fā)表文獻(xiàn)。
人源細(xì)胞系/株須具有細(xì)胞系/株的組織或器官來源、種族及地域來源、年齡、性別、健康狀況及病原體檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)資料。
動(dòng)物來源的細(xì)胞系/株須具有動(dòng)物種屬、種系、飼養(yǎng)條件、組織或器官來源、地域來源、年齡、性別、供體的一般健康狀況及病原體檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)資料。
如采用已建株的細(xì)胞系/株，應(yīng)具有細(xì)胞來源的證明資料。應(yīng)從能夠提供初始細(xì)胞歷史及其溯源性書面證明材料的機(jī)構(gòu)獲得，且應(yīng)提供該細(xì)胞在該機(jī)構(gòu)的詳細(xì)傳代記錄，包括培養(yǎng)過程中使用的所有原材料的詳細(xì)信息，如種類、來源、批號(hào)、生產(chǎn)日期及有效期、制備或使用方法、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)結(jié)果等。
2. 細(xì)胞系/株培養(yǎng)歷史的資料
應(yīng)具有細(xì)胞分離方法、細(xì)胞體外培養(yǎng)過程及細(xì)胞系/株建立過程的相關(guān)資料，包括所使用的物理、化學(xué)或生物學(xué)手段，外源插入序列，篩選細(xì)胞所進(jìn)行的任何遺傳操作或篩選方法、在動(dòng)物體內(nèi)傳代過程以及細(xì)胞生長特征、培養(yǎng)液成分等；同時(shí)還應(yīng)具有細(xì)胞鑒別、內(nèi)源及外源因子檢查結(jié)果的相關(guān)資料。
應(yīng)提供細(xì)胞傳代歷史過程中所用的細(xì)胞培養(yǎng)液的詳細(xì)成分并應(yīng)具有溯源性，如使用人或動(dòng)物源性成分，如血清、胰蛋白酶、乳蛋白水解物或其他生物學(xué)活性的物質(zhì)，應(yīng)具有這些成分的來源、批號(hào)、制備方法、質(zhì)量控制、檢測(cè)結(jié)果和質(zhì)量保證的相關(guān)資料。
?。ǘ┘?xì)胞培養(yǎng)操作要求
細(xì)胞取材、建庫及制備全過程應(yīng)具有可溯源性及操作的一致性，并對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行充分的評(píng)估。
1. 細(xì)胞來源供體
所有類型細(xì)胞的供體應(yīng)無傳染性疾病或未知病原體的疾病。神經(jīng)系統(tǒng)來源的細(xì)胞不得用于疫苗生產(chǎn)。
2. 原材料的選擇
與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的所有材料，特別是人源或動(dòng)物源性材料，應(yīng)按照本版藥典的相關(guān)要求進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，選擇與生產(chǎn)相適應(yīng)的原材料，必要時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。所有生物源性材料均應(yīng)無細(xì)菌、真菌、分枝桿菌、支原體及病毒等外源因子污染。細(xì)胞培養(yǎng)過程中所用的牛血清及胰酶應(yīng)符合本版藥典的相關(guān)要求。
細(xì)胞培養(yǎng)液中不得含有人血清。如果使用人血白蛋白，應(yīng)使用獲得國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)的人用藥品。
細(xì)胞制備過程中不得使用青霉素或β-內(nèi)酰胺（β-Lactam）類抗生素。配制各種溶液的化學(xué)藥品應(yīng)符合本版藥典（四部）或其他相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)體系
應(yīng)控制對(duì)細(xì)胞生長有重大影響的、關(guān)鍵的已知可變因素，包括規(guī)定細(xì)胞培養(yǎng)液及其添加成分的化學(xué)組成及純度；所有培養(yǎng)用試劑應(yīng)有制備記錄并經(jīng)檢定合格后使用，應(yīng)規(guī)定細(xì)胞培養(yǎng)的理化參數(shù)（如pH值、溫度、濕度、氣體組成等）的變化范圍并進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以保證細(xì)胞培養(yǎng)條件的穩(wěn)定性。
4. 細(xì)胞收獲及傳代
應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)工藝的特性，盡可能減少對(duì)細(xì)胞的操作。細(xì)胞收獲及傳代應(yīng)采用可重復(fù)的方式，以保證收獲時(shí)細(xì)胞的匯合率、孵育時(shí)間、溫度、離心速度、離心時(shí)間以及傳代后活細(xì)胞接種密度具有一致性。
傳代細(xì)胞的體外細(xì)胞齡可采用細(xì)胞群體倍增水平或傳代水平計(jì)算。
二倍體細(xì)胞的細(xì)胞齡通常以群體倍增水平計(jì)算，也可以每個(gè)培養(yǎng)容器細(xì)胞群體細(xì)胞數(shù)為基礎(chǔ)，每增加1倍作為1世代粗略估算，即 1 瓶細(xì)胞傳 2 瓶（1 : 2 分種率），再長滿瓶為 1 世代；1 瓶細(xì)胞傳 4 瓶（1 : 4 分種率）為 2 世代；1 瓶細(xì)胞傳 8 瓶（1 : 8 分種率）則為 3 世代。生產(chǎn)用細(xì)胞齡限制在細(xì)胞壽命期限的前 2/3 內(nèi)。
連續(xù)傳代細(xì)胞系的細(xì)胞齡可以群體倍增水平計(jì)算，也可以按照固定的傳代比率進(jìn)行傳代，每傳代 1 次視為 1 代。
5. 細(xì)胞系建立
細(xì)胞系建立過程中進(jìn)行了對(duì)細(xì)胞特性有重要影響的操作，如導(dǎo)致細(xì)胞具有了成瘤性，或經(jīng)細(xì)胞克隆及遺傳修飾等操作的細(xì)胞，應(yīng)被視為一個(gè)新的（或不同的）細(xì)胞系，應(yīng)在原細(xì)胞名稱后增加后綴或編號(hào)重新命名，并重新建立主細(xì)胞庫。
在細(xì)胞克隆過程中，應(yīng)選擇單個(gè)細(xì)胞用于擴(kuò)增，詳細(xì)記錄克隆過程，并根據(jù)整合的重組 DNA 的穩(wěn)定性、細(xì)胞基因組及表型的穩(wěn)定性、生長速率、目的產(chǎn)物表達(dá)水平和完整性及穩(wěn)定性，篩選具有分泌目的蛋白最佳特性的候選克隆，用于建立細(xì)胞種子。
6. 細(xì)胞凍存
應(yīng)在大多數(shù)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存。應(yīng)采用符合細(xì)胞培養(yǎng)物的最佳凍存方法；每一次凍存時(shí)均應(yīng)采用相同的降溫過程，并記錄凍存過程。
每一個(gè)細(xì)胞庫凍存時(shí)，應(yīng)將同一次擴(kuò)增的處于相同倍增水平的細(xì)胞培養(yǎng)物合并，混勻后分裝。每支凍存管中的細(xì)胞數(shù)應(yīng)足以保證細(xì)胞復(fù)蘇后可獲得有代表性的培養(yǎng)物。
對(duì)于一個(gè)新的細(xì)胞庫，除早代培養(yǎng)物在組織采集時(shí)或重組細(xì)胞篩選時(shí)可能需要使用抗生素外，細(xì)胞建庫培養(yǎng)時(shí)不應(yīng)使用抗生素。
7. 生產(chǎn)人員
生產(chǎn)人員應(yīng)定期檢查身體，已知患有傳染性疾病的人員不能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的操作。在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)不得進(jìn)行非生產(chǎn)制品用細(xì)胞或微生物的操作；在同一工作日進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)前，不得接觸動(dòng)物或操作有感染性的微生物。
?。ㄈ┘?xì)胞庫
細(xì)胞庫的建立可為生物制品的生產(chǎn)提供檢定合格、質(zhì)量相同、能持續(xù)穩(wěn)定傳代的細(xì)胞。
細(xì)胞建庫應(yīng)在符合中國現(xiàn)行《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的條件下制備。
1. 細(xì)胞庫的建立
三級(jí)細(xì)胞庫管理包括細(xì)胞種子、主細(xì)胞庫（MCB）及工作細(xì)胞庫（WCB）的管理。在某些特殊情況下，也可采用細(xì)胞種子及 MCB 二級(jí)管理，但須得到國家藥品監(jiān)督管理部門的批準(zhǔn)。
?。?）細(xì)胞種子（Cell Seed）
由一個(gè)原始細(xì)胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細(xì)胞群體，或經(jīng)過克隆培養(yǎng)而形成的均一細(xì)胞群體，通過檢定證明適用于生物制品生產(chǎn)或檢定。在特定條件下，將一定數(shù)量、成分均一的細(xì)胞懸液，定量均勻分裝于一定數(shù)量的安瓿或適宜的細(xì)胞凍存管，于液氮或 -130℃ 以下凍存，即為細(xì)胞種子，供建立主細(xì)胞庫用。
對(duì)于引進(jìn)細(xì)胞，生產(chǎn)者獲得細(xì)胞后，凍存少量細(xì)胞，經(jīng)過驗(yàn)證可用于生物制品生產(chǎn)，此細(xì)胞可作為細(xì)胞種子，供建立主細(xì)胞庫用。
?。?）主細(xì)胞庫（MCB）
取細(xì)胞種子通過規(guī)定的方式進(jìn)行傳代、增殖后，在特定倍增水平或傳代水平同次均勻地混合成一批，定量分裝于一定數(shù)量的安瓿或適宜的細(xì)胞凍存管，保存于液氮或 -130℃ 以下，經(jīng)全面檢定合格后，即可作為主細(xì)胞庫，用于工作細(xì)胞庫的制備。生產(chǎn)企業(yè)的主細(xì)胞庫最多不得超過兩個(gè)細(xì)胞代次。
?。?）工作細(xì)胞庫（WCB）
工作細(xì)胞庫的細(xì)胞由 MCB 細(xì)胞傳代擴(kuò)增制成。由 MCB 的細(xì)胞經(jīng)傳代增殖，達(dá)到一定代次水平的細(xì)胞，合并后制成一批均質(zhì)細(xì)胞懸液，定量分裝于一定數(shù)量的安瓿或適宜的細(xì)胞凍存管中，保存于液氮或-130℃以下備用，即為工作細(xì)胞庫。生產(chǎn)企業(yè)的工作細(xì)胞庫必須限定為一個(gè)細(xì)胞代次。凍存時(shí)細(xì)胞的傳代水平須確保細(xì)胞復(fù)蘇后傳代增殖的細(xì)胞數(shù)量能滿足生產(chǎn)一批或一個(gè)亞批制品。復(fù)蘇后細(xì)胞的傳代水平應(yīng)不超過批準(zhǔn)用于生產(chǎn)的最高限定代次。所制備的 WCB 必須經(jīng)檢定合格［見本通則“一、（四）細(xì)胞檢定”中有關(guān)規(guī)定］后，方可用于生產(chǎn)。
2. 細(xì)胞庫的管理
主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫應(yīng)分別存放。每一個(gè)庫應(yīng)在生產(chǎn)設(shè)施內(nèi)至少 2 個(gè)不同的地點(diǎn)或區(qū)域存放。應(yīng)監(jiān)測(cè)并維護(hù)細(xì)胞庫凍存容器，以保證細(xì)胞庫貯存在一個(gè)高度穩(wěn)定的環(huán)境中。
非生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)與生產(chǎn)用細(xì)胞嚴(yán)格分開存放。
每種細(xì)胞庫均應(yīng)分別建立臺(tái)賬，詳細(xì)記錄放置位置、容器編號(hào)、分裝及凍存數(shù)量、取用情況等。細(xì)胞庫中的每支細(xì)胞均應(yīng)具有細(xì)胞系/株名、代次、批號(hào)、編號(hào)、凍存日期、貯存容器的編號(hào)等信息。
為保證細(xì)胞凍存后仍具有良好的活力，凍存前的細(xì)胞活力應(yīng)不低于 90%，凍存后應(yīng)取一定量的可代表凍存全過程的凍存管復(fù)蘇細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞的活力應(yīng)不低于 80%。二倍體細(xì)胞凍存后，應(yīng)至少做一次復(fù)蘇培養(yǎng)并連續(xù)傳代至衰老期，檢查不同傳代水平的細(xì)胞生長情況。細(xì)胞凍存后，可通過定期復(fù)蘇細(xì)胞及復(fù)蘇后細(xì)胞的活力數(shù)據(jù)驗(yàn)證細(xì)胞在凍存及貯存條件下的穩(wěn)定性。
?。ㄋ模┘?xì)胞檢定
細(xì)胞檢定主要包括以下幾個(gè)方面：細(xì)胞鑒別、外源因子和內(nèi)源因子的檢查、成瘤性/致瘤性檢查等。必要時(shí)還須進(jìn)行細(xì)胞生長特性、細(xì)胞染色體檢查，細(xì)胞均一性及穩(wěn)定性檢查。這些檢測(cè)內(nèi)容對(duì)于 MCB 細(xì)胞和 WCB 細(xì)胞及生產(chǎn)限定代次細(xì)胞均適用。
細(xì)胞檢定項(xiàng)目的基本要求見表1。細(xì)胞庫建立后應(yīng)至少對(duì) MCB 細(xì)胞及生產(chǎn)終末細(xì)胞（EOPC）進(jìn)行一次全面檢定。當(dāng)生產(chǎn)工藝發(fā)生改變時(shí)，應(yīng)重新對(duì) EOPC 進(jìn)行檢測(cè)。每次從 MCB 建立一個(gè)新的 WCB，均應(yīng)按規(guī)定項(xiàng)目進(jìn)行檢定。
注：①表示生產(chǎn)終末細(xì)胞，是指在或超過生產(chǎn)末期時(shí)收獲的細(xì)胞，盡可能取按生產(chǎn)規(guī)模制備的生產(chǎn)末期細(xì)胞。
“+"為必檢項(xiàng)目，“-"為非強(qiáng)制檢定項(xiàng)目。
?。?）表示需要根據(jù)細(xì)胞特性、傳代歷史、培養(yǎng)過程等情況要求的檢定項(xiàng)目。
*表示 MCB 或 WCB。
1. 細(xì)胞鑒別試驗(yàn)
新建細(xì)胞系/株、細(xì)胞庫（ MCB 和 WCB）和生產(chǎn)終末細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，以確認(rèn)為本細(xì)胞，且無其他細(xì)胞的交叉污染。細(xì)胞鑒別試驗(yàn)方法有多種，包括細(xì)胞形態(tài)、生物化學(xué)法（如同工酶試驗(yàn)）、免疫學(xué)檢測(cè)（如組織相容性抗原、種特異性免疫血清）、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)（如染色體核型、標(biāo)記染色體檢測(cè)）、遺傳標(biāo)志檢測(cè)［如 DNA指紋圖譜，包括短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）、限制片段長度多態(tài)性（RFLP-PCR）和內(nèi)含子多態(tài)性（EPIC-PCR）法等］以及其他方法（如雜交法、PCR法、報(bào)告基因法等）。應(yīng)至少選擇上述一種或幾種方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行種屬和細(xì)胞株間及專屬特性的鑒別。
2. 細(xì)菌、真菌無菌檢查
取混合細(xì)胞培養(yǎng)上清液或凍存細(xì)胞管樣品，依法檢查（通則 1101），應(yīng)符合規(guī)定。對(duì)于 MCB 及 WCB 培養(yǎng)物，至少取混合細(xì)胞培養(yǎng)上清液 10ml，盡可能采用薄膜過濾法檢測(cè)。對(duì)于凍存細(xì)胞，至少取凍存細(xì)胞總支數(shù)的 1% 或至少 2 支凍存細(xì)胞管（取量大者），可采用直接接種法檢測(cè)。
3. 分枝桿菌檢查
取至少 107 個(gè)活細(xì)胞用培養(yǎng)上清液制備細(xì)胞裂解物，按照無菌檢查法（通則1101）進(jìn)行分枝桿菌檢查。
取細(xì)胞裂解物接種于適宜的固體培養(yǎng)基（如羅氏培養(yǎng)基或 Middlebrook 7H10 培養(yǎng)基），每個(gè)培養(yǎng)基接種 1ml 并做 3 個(gè)重復(fù)，并同時(shí)以不高于 100CFU 的草分枝桿菌菌液作為陽性對(duì)照。將接種后的培養(yǎng)基置于 37℃ 培養(yǎng) 56 天，陽性對(duì)照應(yīng)有菌生長，接種供試品的培養(yǎng)基未見分枝桿菌生長，則判為合格。
用于外源病毒因子檢查的豚鼠接種法也可檢測(cè)分枝桿菌，按表2所列方法進(jìn)行試驗(yàn)和觀察。豚鼠在注射前應(yīng)觀察4周，結(jié)核菌素試驗(yàn)為陰性者方可用于試驗(yàn)，觀察期末應(yīng)進(jìn)行結(jié)核菌素試驗(yàn)，并剖檢觀察主要臟器是否有結(jié)節(jié)形成。結(jié)核菌素試驗(yàn)為陰性，主要臟器無結(jié)節(jié)，則為符合要求。
也可采用經(jīng)過驗(yàn)證的分枝桿菌核酸檢測(cè)法替代培養(yǎng)法。
4. 支原體檢查
取細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品，依法檢查（通則 3301），應(yīng)符合規(guī)定。
5. 細(xì)胞內(nèi)、外源病毒因子檢查
應(yīng)注意檢查細(xì)胞系/株中是否有來源物種中潛在的可傳染的病毒，以及由于使用的原材料或操作帶入的外源性病毒。細(xì)胞進(jìn)行病毒檢查的種類及方法，須根據(jù)細(xì)胞的種屬來源、組織來源、細(xì)胞特性、傳代歷史、培養(yǎng)方法及過程等確定。如 MCB 進(jìn)行了全面檢定，WCB 需檢測(cè)的外源病毒種類可主要考慮從 MCB 到 WCB 傳代過程中可能引入的病毒，而僅存在于MCB建庫前的病毒可不再重復(fù)檢測(cè)。
?。?）細(xì)胞形態(tài)觀察及血吸附試驗(yàn)
取混合瓶細(xì)胞樣品，接種至少 6 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長成單層或至一定數(shù)量后換維持液，持續(xù)培養(yǎng)兩周。如有必要，可以適當(dāng)換液。逐日鏡檢細(xì)胞，細(xì)胞應(yīng)保持正常形態(tài)特征。
如為貼壁細(xì)胞或半貼壁細(xì)胞，細(xì)胞至少培養(yǎng) 14 天后，分別取 1/3 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，用 0.2%~0.5% 豚鼠紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞混合懸液進(jìn)行血吸附試驗(yàn)。一半加入紅細(xì)胞后置 2~8℃ 作用 30 分鐘，一半置 20~25℃ 作用 30 分鐘，分別進(jìn)行鏡檢，觀察紅細(xì)胞吸附情況，結(jié)果應(yīng)為陰性。
新鮮紅細(xì)胞在 2~8℃ 保存不得超過 7 天，且溶液中不應(yīng)含有鈣或鎂離子。
（2）體外不同指示細(xì)胞接種培養(yǎng)法檢測(cè)病毒因子
用待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備活細(xì)胞或細(xì)胞裂解物，分別接種至少下列三種單層指示細(xì)胞，包括猴源細(xì)胞、人二倍體細(xì)胞和同種屬、同組織類型來源的細(xì)胞。待測(cè)樣本檢測(cè)前，可于 -70℃ 或以下保存。
每種單層指示細(xì)胞至少接種 107 個(gè)活細(xì)胞或相當(dāng)于 107 個(gè)活細(xì)胞的裂解物。接種量應(yīng)占維持液的 1/4 以上，每種指示細(xì)胞至少接種 2 瓶。取培養(yǎng) 7 天的細(xì)胞各 1 瓶，取上清液或細(xì)胞裂解物再分別接種于新鮮制備的相應(yīng)的指示細(xì)胞盲傳一代，與初次接種的另一瓶細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 7 天，觀察細(xì)胞病變，并在觀察期末取細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行血吸附試驗(yàn)；取細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。
用 0.2%~0.5% 豚鼠紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞混合懸液進(jìn)行血吸附試驗(yàn)和紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。將混合紅細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，一半置于 2~8℃ 孵育 30 分鐘，一半置于 20~25℃ 孵育 30 分鐘，分別進(jìn)行鏡檢，觀察紅細(xì)胞吸附情況。取細(xì)胞上清液從原倍起進(jìn)行倍比稀釋后，加入混合紅細(xì)胞，先置 2~8℃ 孵育 30 分鐘，然后置于 20~25℃ 孵育 30 分鐘，分別觀察紅細(xì)胞凝集情況。
接種的每種指示細(xì)胞不得出現(xiàn)細(xì)胞病變，血吸附試驗(yàn)及紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)均應(yīng)為陰性。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)立病毒陽性對(duì)照，包括可觀察細(xì)胞病變的病毒陽性對(duì)照、血吸附陽性對(duì)照及血凝陽性對(duì)照。如待檢細(xì)胞裂解物對(duì)單層細(xì)胞有干擾，則應(yīng)排除干擾因素。
若已知待檢細(xì)胞可支持人或猴巨細(xì)胞病毒（CMV）的生長，則應(yīng)在接種人二倍體細(xì)胞后至少觀察 28 天，應(yīng)無細(xì)胞病變，且血吸附試驗(yàn)及紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)均應(yīng)為陰性。
?。?）動(dòng)物體內(nèi)接種法檢測(cè)外源病毒因子
用待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備活細(xì)胞（或適宜時(shí)采用相當(dāng)量的細(xì)胞裂解物），接種動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行外源病毒因子檢測(cè)。待檢細(xì)胞至少應(yīng)接種乳鼠、成年小鼠和雞胚（兩組不同日齡）共計(jì) 4 組，如為新建細(xì)胞，還需接種豚鼠。原代猴腎細(xì)胞還需用家兔體內(nèi)接種法或兔腎細(xì)胞培養(yǎng)法檢查猴皰疹 B 病毒。按表 2 所列方法進(jìn)行試驗(yàn)和觀察。接種后 24 小時(shí)內(nèi)動(dòng)物死亡超過 20%，試驗(yàn)無效。
觀察期內(nèi)，如被接種動(dòng)物出現(xiàn)異?；蚣膊?yīng)進(jìn)行原因分析，觀察期內(nèi)死亡的動(dòng)物應(yīng)進(jìn)行大體解剖觀察及組織學(xué)檢查，以確定死亡原因。如動(dòng)物顯示有病毒感染，則應(yīng)采用培養(yǎng)法或分子生物學(xué)方法對(duì)病毒進(jìn)行鑒定（如觀察期內(nèi)超過 20% 的動(dòng)物出現(xiàn)死亡，且可明確判定為因動(dòng)物撕咬所致），試驗(yàn)判定為無效，應(yīng)重試。
觀察期末時(shí)，符合下列條件判為合格。
?、偃槭蠛统赡晷∈蠼臃N組 至少應(yīng)有 80% 接種動(dòng)物健存，且小鼠未顯示有可傳播性因子或其他病毒感染。
?、陔u胚接種組 卵黃囊接種的雞胚至少應(yīng)有 80% 存活，且未顯示有病毒感染；尿囊腔接種的雞胚至少應(yīng)有 80% 存活，且尿囊液紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)為陰性。
③豚鼠接種組 至少應(yīng)有 80% 接種動(dòng)物健存，且動(dòng)物未顯示有可傳播性因子或其他病毒感染。
④家兔接種組 至少應(yīng)有 80% 接種動(dòng)物健存，且動(dòng)物未顯示有可傳播性因子或其他病毒感染（包括接種部分損傷）。
?。?）逆轉(zhuǎn)錄病毒及其他內(nèi)源性病毒或病毒核酸的檢測(cè)
可采用下列方法對(duì)待檢細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測(cè)。
①逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定 采用敏感的方法，如產(chǎn)物增強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定法（ PERT 或 PBRT 法）（本通則附錄 1 或其他適宜的方法，但靈敏度不得低于現(xiàn)行方法），但由于細(xì)胞中某些成分也具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性；因此，逆轉(zhuǎn)錄酶陽性的細(xì)胞，應(yīng)進(jìn)一步確認(rèn)是否存在感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒。
②透射電鏡檢查法 取至少 1×107 個(gè)活細(xì)胞采用超薄切片法進(jìn)行透射電鏡觀察。
?、?PCR 法或其他特異性體外法 根據(jù)細(xì)胞的種屬特異性，在逆轉(zhuǎn)錄酶活性結(jié)果不明確或不能采用逆轉(zhuǎn)錄酶活性測(cè)定時(shí)，可采用種屬特異性的逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)法，如逆轉(zhuǎn)錄病毒 PCR 法、免疫熒光法、ELISA 法等，逆轉(zhuǎn)錄病毒的定量 PCR 法還可用于逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的定量。
?、芨腥拘栽囼?yàn) 將待檢細(xì)胞感染逆轉(zhuǎn)錄病毒敏感細(xì)胞，培養(yǎng)后檢測(cè)。根據(jù)待檢細(xì)胞的種屬來源，須使用不同或多種的敏感細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染性試驗(yàn)。
不同的方法具有不同的檢測(cè)特性，逆轉(zhuǎn)錄酶活性提示可能有逆轉(zhuǎn)錄病毒存在，透射電鏡檢查及特異性 PCR 法可證明是否有病毒性顆粒存在并進(jìn)行定量，感染性試驗(yàn)可證明是否有感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒存在，因此應(yīng)采用不同的方法聯(lián)合檢測(cè)。若細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè)為陽性，則需進(jìn)行透射電鏡檢查或 PCR 法及感染性試驗(yàn)，以確證是否存在感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒?？僧a(chǎn)生感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，且下游工藝不能證明病毒被清除的細(xì)胞基質(zhì)不得用于生產(chǎn)。
已知雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）或其他禽源性細(xì)胞含有逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，?？僧a(chǎn)生缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，逆轉(zhuǎn)錄酶活性為陽性，對(duì)這類細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)時(shí)，可直接檢測(cè)細(xì)胞基質(zhì)中是否存在外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒污染，如禽白血病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮病腫瘤病毒、感染性內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。在某些情況下，也可通過監(jiān)測(cè)雞群，以保證無上述感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒污染。
小鼠及其他嚙齒類動(dòng)物來源的細(xì)胞系含有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因序列，可能會(huì)表達(dá)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，因此，對(duì)于這類細(xì)胞系，應(yīng)進(jìn)行感染性試驗(yàn)，以確定所表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒是否具有感染性。對(duì)于特定嚙齒類細(xì)胞（如 CHO、BHK21、NS0 和 Sp2/0），還應(yīng)確定其收獲液中病毒顆粒的量及其是否有感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒，并應(yīng)在生產(chǎn)工藝中增加病毒去除和（或）滅活工藝。僅有高度純化且可證明終產(chǎn)品中逆轉(zhuǎn)錄病毒被清除至低于現(xiàn)行檢測(cè)方法的檢測(cè)限以下時(shí)，方可使用這類細(xì)胞。
?。?）種屬特異性外源病毒因子的檢查
應(yīng)根據(jù)細(xì)胞系/株種屬來源、組織來源及供體健康狀況等確定檢測(cè)病毒的種類。若在 MCB 或 WCB 中未檢測(cè)到種屬特異性病毒，后續(xù)過程中不再進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。
鼠源的細(xì)胞系，可采用小鼠、大鼠和倉鼠抗體產(chǎn)生試驗(yàn)（MAP、RAP 及 HAP）檢測(cè)其種屬特異性病毒。
人源的細(xì)胞系/株，應(yīng)考慮檢測(cè)如人EB病毒、人巨細(xì)胞病毒（HCMV）、人逆轉(zhuǎn)錄病毒（HIV-1/2、HTLV-1/2）、人肝炎病毒（HAV、HBV、HCV）、人細(xì)小病毒 B19、人乳頭瘤病毒、人多瘤病毒、難培養(yǎng)的人腺病毒和人皰疹病毒 -6/7/8 等。
猴源細(xì)胞系/株應(yīng)考慮檢測(cè)猴多瘤病毒（如 SV40）、猴免疫缺陷病毒（SIV）等。
這類病毒的檢測(cè)可采用適當(dāng)?shù)捏w外檢測(cè)技術(shù)，如分子檢測(cè)技術(shù)，但所用方法應(yīng)具有足夠的靈敏度，以保證制品的安全。
?。?）牛源性病毒檢測(cè)
若在生產(chǎn)者建庫之前，細(xì)胞基質(zhì)在建立或傳代歷史中使用了牛血清，則所建立的 MCB 或 WCB 和（或）生產(chǎn)終末細(xì)胞至少應(yīng)按照通則 3604 的要求檢測(cè)一次牛源性病毒。取待檢細(xì)胞用培養(yǎng)上清液制備成至少相當(dāng)于 107 個(gè)活細(xì)胞/ml 的裂解物，進(jìn)行檢測(cè)。如果在后續(xù)生產(chǎn)過程中不再使用牛血清，且 MCB 和（或）EOPC 檢測(cè)顯示無牛源性病毒污染，則后續(xù)工藝中可不再重復(fù)進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
?。?）豬源性病毒的檢測(cè)
如果在生產(chǎn)者建細(xì)胞庫之前，細(xì)胞基質(zhì)在建立或傳代歷史中使用了胰酶，則所建立的 MCB 或 WCB 和（或）超過生產(chǎn)限定水平的細(xì)胞至少應(yīng)檢測(cè)一次與胰酶來源動(dòng)物相關(guān)的外源性病毒，包括豬細(xì)小病毒或牛細(xì)小病毒。如在后續(xù)生產(chǎn)過程中不再使用胰酶，且 MCB 和（或）EOPC 檢測(cè)結(jié)果顯示無相關(guān)動(dòng)物源性病毒污染，則后續(xù)工藝中可不再重復(fù)進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。如使用重組胰酶，應(yīng)根據(jù)胰酶生產(chǎn)工藝可能引入的外源性病毒評(píng)估需要檢測(cè)的病毒種類及方法。
?。?）其他特定病毒的檢測(cè)
根據(jù)細(xì)胞的特性、傳代歷史或培養(yǎng)工藝等確定檢測(cè)病毒的種類。有些細(xì)胞僅對(duì)某些特定病毒易感，采用上述檢測(cè)方法無法檢出，因此需要采用特定的方法檢測(cè)，如對(duì) CHO 細(xì)胞進(jìn)行鼠細(xì)小病毒污染的檢測(cè)等。
6. 成瘤性檢查
成瘤性檢查是確定細(xì)胞基質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)是否能夠形成腫瘤，是對(duì)細(xì)胞特性的鑒定。
新建細(xì)胞系/株及新型細(xì)胞基質(zhì)應(yīng)進(jìn)行成瘤性檢查。
某些傳代細(xì)胞系已證明在一定代次內(nèi)不具有成瘤性，而超過一定代次則具有成瘤性，如Vero細(xì)胞，因此必須進(jìn)行成瘤性檢查。
用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系/株應(yīng)進(jìn)行成瘤性檢查，但當(dāng)未經(jīng)遺傳修飾的二倍體細(xì)胞被證明無成瘤性后，可不作為常規(guī)檢查要求。
已證明具有成瘤性的傳代細(xì)胞，如 BHK21、CHO、HEK293、C127、NS0 細(xì)胞等，或細(xì)胞類型屬成瘤性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞，用于生產(chǎn)治療性制品時(shí)可不再做成瘤性檢查。
成瘤性檢查的方法見本通則附錄 2。具有成瘤性的新建細(xì)胞或新型細(xì)胞基質(zhì)，需采用定量的方法進(jìn)一步分析細(xì)胞成瘤性的大小，并計(jì)算該細(xì)胞的半數(shù)致瘤量（TPD50），并根據(jù)生產(chǎn)工藝及制品的特性，評(píng)估成瘤性的風(fēng)險(xiǎn)。
體內(nèi)法是成瘤性評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)于某些細(xì)胞，也可采用軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)或器官培養(yǎng)試驗(yàn)等體外法檢測(cè)細(xì)胞的成瘤性，特別是對(duì)于低代次、在動(dòng)物體內(nèi)無成瘤性的傳代細(xì)胞系。體外法的結(jié)果可作為細(xì)胞成瘤性評(píng)價(jià)的參考。
7. 致瘤性檢查
致瘤性檢查是保證細(xì)胞基質(zhì)中不存在可使細(xì)胞永生化并具有形成腫瘤的因子。細(xì)胞基質(zhì)致瘤性可能與細(xì)胞 DNA（或其他細(xì)胞成分）或細(xì)胞基質(zhì)中含有致瘤性因子相關(guān)。來源于腫瘤的細(xì)胞或因未知機(jī)制形成腫瘤表型的細(xì)胞，含有致瘤性物質(zhì)的理論風(fēng)險(xiǎn)性相對(duì)較高。
已建株的二倍體細(xì)胞，如 MRC-5、2BS、KMB17、WI-38 及 FRhL-2 新建主細(xì)胞庫不要求進(jìn)行致瘤性檢查。
已建株的或有充分應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)的連續(xù)傳代細(xì)胞，如 CHO、NS0、Sp2/0、低代次的 Vero 細(xì)胞不要求進(jìn)行致瘤性檢查。
新型細(xì)胞基質(zhì)，特別是成瘤性為陽性的細(xì)胞，用于疫苗生產(chǎn)時(shí)，需進(jìn)行致瘤性檢查。
可采用待測(cè)細(xì)胞裂解物和（或）細(xì)胞 DNA 按照本通則附錄 3 的方法進(jìn)行致瘤性檢查。如根據(jù)細(xì)胞基質(zhì)的表型或來源疑似有致瘤性病毒，建議用細(xì)胞基質(zhì)裂解物接種動(dòng)物進(jìn)行致瘤性檢查；若細(xì)胞基質(zhì)具有成瘤性表型，建議用細(xì)胞 DNA 接種動(dòng)物進(jìn)行致瘤性檢查。
對(duì)致瘤性檢查中出現(xiàn)進(jìn)行性結(jié)節(jié)的細(xì)胞，應(yīng)開展進(jìn)一步的研究，鑒別致瘤性因子或致瘤性活性，并確定細(xì)胞的可適用性。
?。ㄎ澹┥a(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)
生產(chǎn)用原材料的選擇和細(xì)胞操作環(huán)境應(yīng)符合本通則“一、（二）細(xì)胞培養(yǎng)操作要求”及“一、（三）1. 細(xì)胞庫的建立”中有關(guān)規(guī)定。
從凍存的 WCB 中取出 1 支或多支安瓿，混合后培養(yǎng)，傳至一定代次后供生產(chǎn)用。其代次不得超過該細(xì)胞用于生產(chǎn)的最高限定代次。生產(chǎn)用細(xì)胞的最高限定代次應(yīng)根據(jù)研究結(jié)果確定，但不得超過國際認(rèn)可的最高限定代次。從 WCB 取出的細(xì)胞經(jīng)增殖后獲得的細(xì)胞不得再回凍保存用于生產(chǎn)。
二、連續(xù)傳代細(xì)胞系的特殊要求
傳代細(xì)胞系一般是由人或動(dòng)物腫瘤組織或正常組織傳代或轉(zhuǎn)化而來，可懸浮培養(yǎng)或采用微載體培養(yǎng)，能大規(guī)模生產(chǎn)。這些細(xì)胞可無限傳代，但到一定代次后，成瘤性會(huì)增強(qiáng)。應(yīng)按本通則“一、（四）細(xì)胞檢定”的規(guī)定進(jìn)行細(xì)胞庫的檢查。對(duì)生產(chǎn)過程中細(xì)胞培養(yǎng)的要求如下。
1. 用于生產(chǎn)的細(xì)胞代次
用于生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系，代次應(yīng)有一定限制。用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞最高限定代次須經(jīng)批準(zhǔn)。
2. 生產(chǎn)過程中的細(xì)胞檢查
除另有規(guī)定外，病毒類制品，在生產(chǎn)末期，取不接種病毒的對(duì)照細(xì)胞，按本通則“一、（四）1. 細(xì)胞鑒別試驗(yàn)，2. 細(xì)菌、真菌無菌檢查，4. 支原體檢查”以及病毒外源因子檢查法（通則 3302），應(yīng)符合規(guī)定。
三、人二倍體細(xì)胞株的特殊要求
新建的人二倍體細(xì)胞必須具有以下資料：建立細(xì)胞株所用胎兒的胎齡和性別、終止妊娠的原因、所用胎兒父母的年齡、職業(yè)及健康良好的證明（醫(yī)師出具的健康狀態(tài)良好、無潛在性傳染病和遺傳性疾患等證明），以及胎兒父系及母系三代應(yīng)無明顯遺傳缺陷疾病史的書面資料。
人二倍體細(xì)胞株應(yīng)在傳代過程的早期，選擇適當(dāng)世代水平（ 2~8 世代）增殖出大量細(xì)胞，定量分裝后，置液氮中或 -130℃ 下凍存，供建立細(xì)胞種子之用，待全部檢定合格后，即可正式定為細(xì)胞種子，供制備 MCB 用。
1. 染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn)
新建人二倍體細(xì)胞株及其細(xì)胞庫必須進(jìn)行染色體檢查。對(duì)于已建株的人二倍體細(xì)胞株，如 WI-38、MRC-5、2BS、KMB17 等，在建立 MCB 時(shí)可不必進(jìn)行細(xì)胞染色體檢查；但如對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了遺傳修飾，則須按新建細(xì)胞株進(jìn)行染色體檢查。
（1）染色體檢查
新細(xì)胞建株過程中，每 8~12 世代應(yīng)做一次染色體檢查，在1株細(xì)胞整個(gè)生命期內(nèi)的連續(xù)培養(yǎng)過程中，應(yīng)至少有 4 次染色體檢查結(jié)果。每次染色體檢查，應(yīng)至少隨機(jī)取 1000 個(gè)分裂中期細(xì)胞，進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)檢查，并做記錄，以備復(fù)查。其中至少選擇 50 個(gè)分裂中期細(xì)胞進(jìn)行顯微照相，作出核型分析，并應(yīng)粗?jǐn)?shù) 500 個(gè)分裂中期細(xì)胞，檢查多倍體的發(fā)生率。
每次染色體檢查，應(yīng)從同一世代的不同培養(yǎng)瓶中取細(xì)胞，混合后進(jìn)行再培養(yǎng)，制備染色體標(biāo)本片。染色體標(biāo)本片應(yīng)長期保存，以備復(fù)查。
可用 G 分帶或 Q 分帶技術(shù)檢查 50 個(gè)分裂中期細(xì)胞染色體帶型，并作出帶型分析。
?。?）判定標(biāo)準(zhǔn)
對(duì) 1000 個(gè)和 500 個(gè)分裂中期細(xì)胞標(biāo)本異常率進(jìn)行檢查，合格的上限（可信限 90% Poison 法）見表 3。
2. 無菌檢查
每 8~12 世代細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行無菌檢查，依法檢查（通則 1101），應(yīng)符合規(guī)定。
3. 支原體檢查
每 8~12 世代細(xì)胞培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行支原體檢查，依法檢查（通則 3301），應(yīng)符合規(guī)定。
4. 病毒檢查
二倍體細(xì)胞株傳代過程中，至少對(duì) 2 個(gè)不同世代水平進(jìn)行病毒包涵體及特定人源病毒檢查［見本通則一、（四）5.（5）種屬特異性外源病毒因子的檢查］，結(jié)果應(yīng)均為陰性。
5. 成瘤性檢查
每 8~12 世代應(yīng)做一次成瘤性檢查［方法見本通則一、（四）6. 成瘤性檢查］，結(jié)果應(yīng)無成瘤性。
6. 生產(chǎn)過程中的細(xì)胞檢查
除另有規(guī)定外，在生產(chǎn)末期，取不接種病毒的細(xì)胞作為對(duì)照，進(jìn)行以下各項(xiàng)檢定，應(yīng)符合規(guī)定。
?。?）染色體檢查
可根據(jù)制品特性及生產(chǎn)工藝，確定是否進(jìn)行生產(chǎn)過程中細(xì)胞的染色體檢查。通常含有活細(xì)胞的制品或下游純化工藝不足的制品，應(yīng)對(duì)所用細(xì)胞進(jìn)行染色體檢查及評(píng)價(jià)［見本通則三、1. 染色體檢查及判定標(biāo)準(zhǔn)］；但如采用已建株的人二倍體細(xì)胞生產(chǎn)，則不要求進(jìn)行染色體核型檢查。
（2）細(xì)胞鑒別試驗(yàn)
按本通則“一、（四）細(xì)胞檢定”項(xiàng)下細(xì)胞鑒別試驗(yàn)進(jìn)行。生產(chǎn)用細(xì)胞每年應(yīng)至少進(jìn)行一次該項(xiàng)檢定。
?。?）無菌檢查
依法檢查（通則 1101），應(yīng)符合規(guī)定。
?。?）支原體檢查
依法檢查（通則 3301），應(yīng)符合規(guī)定。
?。?）對(duì)照細(xì)胞外源病毒因子檢查
依法檢查（通則 3302），應(yīng)符合規(guī)定。
四、重組細(xì)胞的特殊要求
重組細(xì)胞系通過 DNA 重組技術(shù)獲得的含有特定基因序列的細(xì)胞系，因此重組細(xì)胞系的建立應(yīng)具有細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)建方法的相關(guān)資料，如細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染、篩選、集落分離、克隆、基因擴(kuò)增及培養(yǎng)條件或培養(yǎng)液的適應(yīng)性等方面的資料。細(xì)胞庫細(xì)胞的檢查除應(yīng)按本通則“一、（四）細(xì)胞檢定”的規(guī)定進(jìn)行，還應(yīng)進(jìn)行下述檢查。
1. 細(xì)胞基質(zhì)的穩(wěn)定性
生產(chǎn)者須具有該細(xì)胞用于生產(chǎn)的目的基因的穩(wěn)定性資料，穩(wěn)定性檢測(cè)的項(xiàng)目及方法依據(jù)產(chǎn)品的特性確定，對(duì)于細(xì)胞基質(zhì)來說，穩(wěn)定性的分析是保證 MCB/WCB 與 EOPC 之間的一致性，包括重組細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性（如插入基因拷貝數(shù)、插入染色體的位點(diǎn)、插入基因的序列等）、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性、目的產(chǎn)品持續(xù)生產(chǎn)的穩(wěn)定性，以及一定條件下保存時(shí)細(xì)胞生產(chǎn)目的產(chǎn)品能力的穩(wěn)定性等資料。
2. 細(xì)胞鑒別試驗(yàn)
除按本通則“一、（四）1. 細(xì)胞鑒別試驗(yàn)”進(jìn)行外，還應(yīng)通過檢測(cè)目的蛋白基因或目的蛋白進(jìn)行鑒別試驗(yàn)。
五、原代細(xì)胞的要求
原代細(xì)胞應(yīng)來源于健康的動(dòng)物臟器組織或胚胎，包括猴腎、地鼠腎、沙鼠腎、家兔腎、犬腎等動(dòng)物臟器或動(dòng)物的胎兒和其他組織，以及雞胚和鵪鶉胚等正常組織，以適當(dāng)?shù)南合?、分散組織細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，原代細(xì)胞不能建立細(xì)胞庫，只能限于原始培養(yǎng)的細(xì)胞或傳代少數(shù)幾代內(nèi)（一般不超過 5 代）使用，無法事先確定細(xì)胞代次。因此，只能嚴(yán)格規(guī)范管理和操作措施，以保證以原代細(xì)胞為基質(zhì)所生產(chǎn)的制品質(zhì)量。
?。ㄒ唬﹦?dòng)物組織來源和其他材料
1. 動(dòng)物組織來源
應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。對(duì)各種動(dòng)物都應(yīng)有明確健康狀況和潔凈級(jí)別要求。
2. 生產(chǎn)或檢定用猴
多采用非洲綠猴、恒河猴等，中國以恒河猴為主。應(yīng)為籠養(yǎng)或小群混養(yǎng)的正常健康猴。動(dòng)物用于制備細(xì)胞前，應(yīng)有6周以上的檢疫期，檢疫期中出現(xiàn)病猴或混入新猴，應(yīng)重新檢疫。從外面新引入的猴群應(yīng)做結(jié)核菌素試驗(yàn)及猴皰疹I(lǐng)型病毒（ B 病毒）的檢查。
胎猴腎可用于生產(chǎn)，對(duì)其母猴應(yīng)進(jìn)行檢疫。
?。ǘ┰?xì)胞培養(yǎng)物的檢查
用于細(xì)胞制備的動(dòng)物剖檢應(yīng)正常，取留的器官組織亦應(yīng)正常，如有異常，不能用于制備細(xì)胞。
1. 細(xì)胞培養(yǎng)原材料檢查及細(xì)胞培養(yǎng)操作
按本通則“一、（二）細(xì)胞培養(yǎng)操作要求”項(xiàng)進(jìn)行。
2. 細(xì)胞培養(yǎng)物的檢查
?。?）細(xì)胞形態(tài)檢查
細(xì)胞在接種病毒或用于生產(chǎn)前，其培養(yǎng)物均應(yīng)進(jìn)行外觀檢查和鏡檢，應(yīng)無任何可疑、異常和病變，否則不得用于生產(chǎn)。
（2）特定病毒檢查
原代猴腎細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)檢查 SV40 病毒、猴免疫缺陷病毒和 B 病毒；應(yīng)采用 Vero 或原代綠猴腎細(xì)胞、兔腎細(xì)胞檢查。地鼠腎原代細(xì)胞應(yīng)采用 BHK21 細(xì)胞培養(yǎng)檢查。觀察細(xì)胞形態(tài)，如有可疑應(yīng)在同種細(xì)胞上盲傳一代繼續(xù)觀察。
?。?）對(duì)照細(xì)胞外源病毒因子檢查
依法檢查（通則 3302），應(yīng)符合規(guī)定。
六、檢定用細(xì)胞的要求
檢定用細(xì)胞是指用于生物制品檢定的細(xì)胞，包括原代細(xì)胞、連續(xù)傳代細(xì)胞或二倍體細(xì)胞，以及經(jīng)特定基因修飾過的細(xì)胞。檢定用細(xì)胞的質(zhì)量對(duì)檢定結(jié)果的判定具有重要的影響，為保證檢定結(jié)果的有效性、可靠性及真實(shí)性，檢定用細(xì)胞應(yīng)符合下列要求。
?。ㄒ唬┘?xì)胞資料
1. 檢定用細(xì)胞應(yīng)具有明確合法來源的證明資料。
2. 如使用傳代細(xì)胞系/株，應(yīng)建立細(xì)胞庫體系，即主細(xì)胞庫及工作細(xì)胞庫，如細(xì)胞使用量較少，可建立單一主細(xì)胞庫。應(yīng)根據(jù)制品特性，在保證檢測(cè)結(jié)果可靠性的基礎(chǔ)上，通過驗(yàn)證確定該細(xì)胞允許使用的最高限定代次，在此基礎(chǔ)上規(guī)定檢定用細(xì)胞的使用代次范圍。檢定時(shí)從工作細(xì)胞庫復(fù)蘇細(xì)胞后，不能再回凍保存。
3. 應(yīng)詳細(xì)記錄檢定用細(xì)胞建庫的過程，包括細(xì)胞培養(yǎng)所用原材料的來源、批號(hào)，細(xì)胞生長液的配制方法、使用濃度等，以及細(xì)胞的傳代及凍存過程，并建立細(xì)胞凍存及使用臺(tái)賬。
?。ǘ┘?xì)胞檢定
應(yīng)至少進(jìn)行以下 1~3 項(xiàng)檢定，根據(jù)檢定用細(xì)胞用途的不同，還應(yīng)進(jìn)行以下其他相關(guān)項(xiàng)目的檢定。
1. 細(xì)胞鑒別試驗(yàn)
按本通則“一、（四）1. 細(xì)胞鑒別試驗(yàn)”項(xiàng)進(jìn)行，或其他適宜的方法，應(yīng)確認(rèn)為本細(xì)胞，并且無其他細(xì)胞的交叉污染。
2. 無菌檢查
依法檢查（通則 1101），應(yīng)符合要求。
3. 支原體檢查
依法檢查（通則 3301），應(yīng)符合要求。
4. 外源病毒因子檢查
采用本通則“一、（四）5.（2）體外不同指示細(xì)胞接種培養(yǎng)法檢測(cè)病毒因子”項(xiàng)及本通則“一、（四）5.（3）動(dòng)物體內(nèi)接種法檢測(cè)外源病毒因子”項(xiàng)檢查，應(yīng)無外源病毒污染。
5. 其他檢測(cè)
?。?）成瘤性檢查
用于成瘤性檢查的陽性對(duì)照細(xì)胞，應(yīng)采用本通則“一、（四）6. 成瘤性檢查”項(xiàng)進(jìn)行檢查，應(yīng)具有成瘤性。
?。?）病毒敏感性檢查
用于檢測(cè)活疫苗制品病毒滴度的細(xì)胞，應(yīng)進(jìn)行此項(xiàng)檢查，證明所用細(xì)胞具有足夠的相應(yīng)病毒敏感性。
?。?）細(xì)胞功能檢查
用于生物學(xué)活性、效力或效價(jià)測(cè)定的細(xì)胞，應(yīng)進(jìn)行此項(xiàng)檢查，證明所用細(xì)胞能夠有效評(píng)價(jià)待檢樣品質(zhì)量。
附錄1 逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢查法
本法系以噬菌體 MS2 RNA 為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后再采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)特異性擴(kuò)增信號(hào)，從而測(cè)定供試品中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。
試劑
?。?）供試品稀釋液（A 液） 每 1L A 液含三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（ Tris-HCl，pH 7.5） 25mmol，氯化鉀 50mmol，二硫蘇糖醇（ DTT ） 5mmol，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2，pH8.0） 0.25mmol，TritonX-100 25ml，甘油 500ml。配制時(shí)，最后添加 DTT，混合后分裝，-20℃ 保存，備用。
?。?）供試品保存液（B 液） 每 1L A 液中含 1mg 亮抑蛋白酶肽、0.7mg 抑胃肽及 1mg 抑蛋白酶肽。
?。?）引物及探針序列
上游引物：5'-AACATGCTCGAGGGCCTTA-3'
反轉(zhuǎn)錄及下游引物：5'-GCCTTAGCAGTGCCCTGTCT-3'
探針：5'-(FAM)-CCCGTGGGATGCTCCTACATGTCA-(TAMRA)-3'
（4）模板 噬菌體 MS2 RNA。
?。?）反轉(zhuǎn)錄緩沖液 每1L反轉(zhuǎn)錄緩沖液含 Tris-HCl（pH8.3） 50mmol，氯化鉀 40mmol，氯化鎂 6mmol，DTT 2mmol，脫氧核糖核苷酸 200μmol，下游引物 0.8×10-3mmol。
?。?）擴(kuò)增緩沖液 可采用市售熒光定量PCR混合液（Mix），每 30μl 反應(yīng)體系中，加入上、下游引物各 2×10-8mmol，探針 6×10-9mmol，核糖核酸酶 A 10μg。若 Mix 中不含有 Taq DNA 聚合酶，可加入 2U 的 Taq DNA聚合酶。
供試品、陽性對(duì)照及靈敏度對(duì)照的制備
（1）取供試品 200μl，每分鐘 5000 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘，取上清液 100μl，加入 B 液 100μl 和焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的 5%TritonX-100 2μl，混勻后，置冰浴 15 分鐘后，置-70℃ 保存?zhèn)溆谩? （2）陽性對(duì)照 用 Sp 2/0 細(xì)胞培養(yǎng)上清液作陽性對(duì)照，同（1）處理后，按單次使用量分裝，-70℃ 保存?zhèn)溆谩? ?。?）標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度對(duì)照制備 取 0.5μl 莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLVRT）（200U/μ1）加至 99.5μl A 液中，上下吹打 10 次并渦旋混勻，即將M-MLVRT稀釋為 1012pU/μl（1U/μl）。以此樣本為初始樣本，取 5μl 至 45μl A 液中，上下吹打 10 次并渦旋混勻，如此方法進(jìn)行 10 倍系列稀釋至 103pU/μl，每次稀釋時(shí)均采用新吸頭吸取樣本。
取 104~109pU/μl 稀釋度的 M-MLVRT 作標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)。104pU/μl 稀釋度樣本作為靈敏度對(duì)照。置冰浴備用。
檢查法
?。?）反轉(zhuǎn)錄
將已處理的供試品及陽性對(duì)照用 A 液做 10 倍稀釋。
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管中加入反轉(zhuǎn)錄緩沖液 19.7μl，800ng/μl MS2 RNA 0.3μl，混勻后，標(biāo)記，70℃放置10分鐘，置冰浴。
在相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管中分別加入5μl已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、供試品、陽性對(duì)照及靈敏度對(duì)照，以 A 液作陰性對(duì)照。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為 25μl。37℃ 反應(yīng) 4 小時(shí)。
?。?）實(shí)時(shí)熒光 PCR 擴(kuò)增
取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5μl 加至實(shí)時(shí)熒光 PCR 擴(kuò)增緩沖液 25μl 中，反應(yīng)總體系為 30μl。混勻后，按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：37℃7 分鐘，預(yù)變性 95℃5 分鐘，然后 95℃20 秒，57℃60 秒，72℃10 秒，進(jìn)行 50 個(gè)循環(huán)，在 57℃ 時(shí)采集信號(hào)，最后 72℃ 延伸 2 分鐘。
結(jié)果判定
?。?）實(shí)驗(yàn)方法靈敏度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)
靈敏度分析：分別檢測(cè) 104pU/pd、103pU/μl 供試品各 10 個(gè)重復(fù)。至少 104pU/μl 的供試品應(yīng)全部檢出（10/10），
實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度為合格。
?。?）試驗(yàn)有效性
標(biāo)準(zhǔn)曲線R應(yīng)不低于 0.960，陽性對(duì)照應(yīng)為陽性，Ct 值應(yīng)≤28；靈敏度對(duì)照應(yīng)為陽性，Ct 值應(yīng)≤38；視為試驗(yàn)有效。
?。?）待測(cè)樣本結(jié)果判定
①如果待測(cè)樣本無 Ct 值結(jié)果，或 Ct 值≥40，且無明顯的擴(kuò)增曲線，則判定待測(cè)樣本中逆轉(zhuǎn)錄酶活性為陰性。
②如果待測(cè)樣本的 Ct 值結(jié)果＜40，且有明顯的擴(kuò)增曲線，則按照下式計(jì)算樣本中逆轉(zhuǎn)錄酶活性單位。
待測(cè)樣本中逆轉(zhuǎn)錄酶活性單位（pU/ml）= A × D × 1000
式中 A 為測(cè)定值，pU/μl；
D 為樣本稀釋倍數(shù)，D = 20。
注意事項(xiàng)
?。?）如供試品為培養(yǎng)細(xì)胞，則將細(xì)胞傳代后，培養(yǎng) 3~4 天長成單層，取上清液檢測(cè)，取供試品前不得換液。
?。?）試驗(yàn)中所有試劑及吸頭均需滅菌。與 RNA 操作有關(guān)的試劑及材料均需經(jīng)過 DEPC 處理。
（3）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋時(shí)，用新吸頭吸取上一個(gè)稀釋度樣本加至下一個(gè)稀釋管中，反復(fù)吹吸 10 次，并渦旋混合均勻，然后換新吸頭進(jìn)行下一個(gè)稀釋。
?。?）與樣本相關(guān)的操作建議使用帶濾芯吸頭，并注意實(shí)驗(yàn)分區(qū)。
（5）定期對(duì)各區(qū)進(jìn)行消毒，PCR 產(chǎn)物及其加供試品吸頭應(yīng)及時(shí)進(jìn)行有效處理。
附錄2 成瘤性檢查法
成瘤性是指待檢細(xì)胞接種動(dòng)物后，接種細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)形成（腫）瘤的過程，成瘤性檢查的目的是確定細(xì)胞基質(zhì)接種動(dòng)物后形成（腫）瘤的能力。
待檢細(xì)胞制備
從 MCB 或 WCB 復(fù)蘇細(xì)胞，擴(kuò)增至或超過生產(chǎn)用細(xì)胞齡限定代次 10 代以上，收獲細(xì)胞并懸于無血清液體中（如 PBS），制備成濃度為每 1ml 含 5×107 個(gè)活細(xì)胞的待檢細(xì)胞懸液，細(xì)胞活力應(yīng)不低于 90%，用于成瘤性檢測(cè)。
陽性對(duì)照細(xì)胞
用 HeLa 或 HeLa S3 細(xì)胞或其他已知成瘤性為陽性的細(xì)胞，擴(kuò)增至所需細(xì)胞量，用與待檢細(xì)胞相同的液體懸浮細(xì)胞，并制備成濃度為每 1ml 含 5×106 個(gè)活細(xì)胞的懸液，細(xì)胞活力應(yīng)不低于 90%，作為陽性對(duì)照細(xì)胞。
陰性對(duì)照細(xì)胞
如需要，可用人二倍體細(xì)胞作為陰性對(duì)照，擴(kuò)增至所需細(xì)胞量，用與待檢細(xì)胞相同的液體懸浮細(xì)胞，制備成濃度為每 1ml 含 5×107 個(gè)活細(xì)胞的待檢細(xì)胞懸液，細(xì)胞活力應(yīng)不低于 90%，作為陰性對(duì)照細(xì)胞。
動(dòng)物
下述兩種動(dòng)物可任選其一。
?。?）裸鼠 4~7 周齡，盡量用雌鼠，每組至少 10 只。如使用新生裸鼠，則為 3~5 日齡。
?。?）新生小鼠 3~5 日齡，體重 8~10g 小鼠，每組 10 只，在出生后第 0 天、第 2 天、第 7 天和第 14 天，分別用 0.1ml 抗胸腺血清（ATS）或球蛋白處理后用于試驗(yàn)。
動(dòng)物接種
待檢細(xì)胞組每只裸鼠皮下或肌內(nèi)注射待檢細(xì)胞 0.2ml（即每只裸鼠接種 107 個(gè)活細(xì)胞）；陽性對(duì)照組每只注射陽性對(duì)照細(xì)胞 0.2ml，含 106 個(gè)活細(xì)胞。皮下接種時(shí)細(xì)胞應(yīng)接種于裸鼠背部區(qū)域，肌肉接種時(shí)細(xì)胞應(yīng)接種于裸鼠大腿部位。對(duì)于弱成瘤性表型的細(xì)胞或新建細(xì)胞，最好再使用新生裸鼠進(jìn)行成瘤性試驗(yàn)，每只接種 0.1ml，含 107 個(gè)活細(xì)胞。
觀察
應(yīng)定期觀察及觸摸所有動(dòng)物在注射部位是否有結(jié)節(jié)形成，至少觀察 16 周（至少 4 個(gè)月），前 3~6 周，每周觀察 2 次，之后每周觀察 1 次，并記錄結(jié)果。
結(jié)果分析及判定
（1）如注射部位有結(jié)節(jié)形成，應(yīng)對(duì)結(jié)節(jié)進(jìn)行雙向測(cè)量，并記錄每周的測(cè)量結(jié)果，以判定結(jié)節(jié)是否為進(jìn)行性、穩(wěn)定還是消退。
（2）陽性對(duì)照組應(yīng)至少有 9 只動(dòng)物有進(jìn)行性腫瘤生長時(shí)，試驗(yàn)才視為有效。
?。?）對(duì)出現(xiàn)的結(jié)節(jié)開始消退的動(dòng)物，應(yīng)在觀察期末處死。不能形成進(jìn)行性結(jié)節(jié)的細(xì)胞，不視為具有成瘤性。
細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)沒有形成進(jìn)行性結(jié)節(jié)，但結(jié)節(jié)在觀察期內(nèi)始終存留，且具有瘤的組織病理學(xué)形態(tài)時(shí)，則需考慮是否需要開展進(jìn)一步的檢測(cè)，如延長觀察時(shí)間或采用新生裸鼠或其他動(dòng)物模型分析細(xì)胞是否具有成瘤性。
?。?）在觀察期末，處死所有動(dòng)物，包括對(duì)照組動(dòng)物，肉眼及顯微觀察注射部位及其他部位（如心臟、肺、肝、脾、腎、腦及局部淋巴結(jié)）是否有接種細(xì)胞增生。將這些組織用 3.7%~4.0% 甲醛溶液固定、切片，并用蘇木精和伊紅染色后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，判定接種細(xì)胞是否形成腫瘤或有轉(zhuǎn)移瘤。如果有轉(zhuǎn)移瘤形成，則需進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)移瘤的性質(zhì)及與原發(fā)瘤的相關(guān)性，并深入分析轉(zhuǎn)移瘤形成的原因。
?。?）如待檢細(xì)胞接種組 10 只動(dòng)物中至少有 2 只在注射部位或轉(zhuǎn)移部位形成瘤，并且組織病理學(xué)及基因型分析顯示形成瘤的細(xì)胞性質(zhì)與接種的細(xì)胞一致時(shí)，則可判定為待檢細(xì)胞具有成瘤性。
?。?）如待檢細(xì)胞接種組 10 只動(dòng)物中僅有 1 只形成瘤且滿足本檢查法（5）的條件，則待測(cè)細(xì)胞可能具有成瘤性，需要做進(jìn)一步的分析。
附錄3 致瘤性檢查法
致瘤性是指將待檢細(xì)胞的細(xì)胞成分接種動(dòng)物后，誘導(dǎo)動(dòng)物本身細(xì)胞形成腫瘤的特性，可參照下列方法進(jìn)行檢查。
接種動(dòng)物及數(shù)量
采用新生（出生 3 日齡內(nèi)）裸鼠、新生倉鼠及新生大鼠進(jìn)行致瘤性檢查，動(dòng)物接種數(shù)量應(yīng)多于成瘤性檢查用量。
待檢細(xì)胞
來源于 MCB 或 WCB 的細(xì)胞擴(kuò)增至或超過生產(chǎn)用體外細(xì)胞齡至少 3~10 個(gè)細(xì)胞倍增水平，用于致瘤性檢查。
對(duì)照
細(xì)胞裂解物陽性對(duì)照尚不明確，DNA 陽性對(duì)照可采用含有致瘤性基因的在動(dòng)物體內(nèi)可引起致瘤的 DNA 質(zhì)粒。設(shè)置陰性對(duì)照可監(jiān)測(cè)接種動(dòng)物的自發(fā)腫瘤發(fā)生頻率。設(shè)置陰性對(duì)照可根據(jù)具體情況而定，可采用 PBS 作為陰性對(duì)照。
供試品制備及接種
?。?）細(xì)胞裂解物
采用對(duì)病毒破壞最小且能最大釋放病毒的方法制備細(xì)胞裂解物，如可采用 3 次凍融及低速離心法，將樣本懸浮于 PBS 中，取含 107 個(gè)細(xì)胞的裂解物 50~100μl 分別于肩胛骨處皮下接種新生裸鼠、新生倉鼠及新生大鼠。接種前應(yīng)確認(rèn)樣本中無活細(xì)胞存在，以免影響結(jié)果的有效性。
?。?）細(xì)胞 DNA
提取細(xì)胞基質(zhì)全細(xì)胞 DNA 懸浮于 PBS 中，可適度進(jìn)行超聲波等剪切處理，取 50~100μl 含不低于 100μg 的 DNA 樣本分別于肩胛骨處皮下接種新生裸鼠、新生倉鼠及新生大鼠。陽性對(duì)照組應(yīng)將陽性對(duì)照質(zhì)粒與待測(cè)細(xì)胞 DNA 混合后接種，以確認(rèn)待測(cè)樣本無抑制效應(yīng)。
結(jié)果觀察及分析
?。?）每周觀察并觸摸接種部位是否有結(jié)節(jié)形成，應(yīng)至少觀察 4 個(gè)月。
?。?）觀察期內(nèi)如有 1 個(gè)或多個(gè)結(jié)節(jié)出現(xiàn)，則應(yīng)每周雙向測(cè)量結(jié)節(jié)大小并記錄結(jié)果，以確定結(jié)節(jié)是進(jìn)行性生長、保持穩(wěn)定還是隨時(shí)間而消退。有進(jìn)行性結(jié)節(jié)生長的動(dòng)物，當(dāng)結(jié)節(jié)達(dá)到直徑約 2cm 或國家規(guī)定的大小時(shí)應(yīng)處死。
?。?）觀察期末，所有動(dòng)物均應(yīng)處死，肉眼及顯微觀察接種部位或其他部位是否有瘤形成。任何疑似瘤均應(yīng)采用適宜濃度甲醛溶液固定后進(jìn)行組織學(xué)檢查。如可行，建立細(xì)胞系并凍存后，以備進(jìn)行后續(xù)的分子技術(shù)分析。
?。?）顯微檢查肝、心、肺、脾及局部淋巴結(jié)是否存在轉(zhuǎn)移性損傷。如有腫瘤形成，則要分析與接種部位原發(fā)瘤的相關(guān)性；如組織學(xué)檢查顯示與原發(fā)瘤不同，則要考慮可能有自發(fā)瘤形成，這種情況需跟蹤結(jié)果。
結(jié)果判定
?。?）觀察期末，如接種部位或其他遠(yuǎn)端部位未觀察到進(jìn)行性生長腫瘤，可判定細(xì)胞無致瘤性。
（2）在致瘤性檢查中形成的所有腫瘤均應(yīng)檢查其基因組 DNA，分析是否有細(xì)胞基質(zhì)物種來源的 DNA 及接種動(dòng)物來源的 DNA，致瘤性試驗(yàn)中形成的腫瘤應(yīng)為接種動(dòng)物宿主 DNA。保存所有的腫瘤樣本，以備必要時(shí)開展深入研究。
?。?）對(duì)致瘤性檢查中出現(xiàn)進(jìn)行性結(jié)節(jié)的細(xì)胞基質(zhì)，應(yīng)考慮開展進(jìn)一步的研究，鑒別致瘤性因子或致瘤性活性，并確定細(xì)胞的可適用性。
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