泛癌免疫基因組分析揭示基因型與免疫表型的關(guān)系和檢查點阻斷反應(yīng)的預(yù)測因子

Pan-cancer Immunogenomic Analyses Reveal Genotype-Immunophenotype Relationships and Predictors of Response to Checkpoint Blockade

研究背景

1、免疫治療正在改變的晚期腫瘤的治療情況，但仍有很多患者對免疫治療沒有好的反應(yīng)。
2、以前的研究使用TCGA的基因組數(shù)據(jù)來描述新抗原及其與生存的關(guān)系，或使用兩個基因的表達估計細胞溶解。 然而，這些研究并沒有描述腫瘤內(nèi)免疫浸潤的細胞組成。

本文通過對基因組的數(shù)據(jù)進行分析，描述腫瘤內(nèi)免疫細胞的浸潤情況，進而發(fā)現(xiàn)其中基因與免疫表型的關(guān)系，并預(yù)測免疫治療的效果。

全文概要

上圖示本文基本框架，通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行分析，提取腫瘤中淋巴細胞浸潤、新抗原和CGAs（腫瘤-種系抗原）的信息，并將結(jié)果存放在TCIA數(shù)據(jù)庫中，對其中的免疫表型信息進行分類，計算免疫表型評分。然后在腫瘤組織中進行驗證，先進行RNA測序，將測序結(jié)果用前面的方法進行免疫表型評分，根據(jù)免疫表型評分的情況作出相應(yīng)的免疫表型圖，并發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出左邊這種免疫表型的腫瘤免疫治療好，表現(xiàn)為右邊這種免疫表型圖的患者免疫治療的效果欠佳。

腫瘤免疫的高分辨率基因組分析

免疫基因組學(xué)分析和用于分析的數(shù)據(jù)類型

泛癌免疫基因組學(xué)分析的流程圖：首先從TCGA數(shù)據(jù)庫和抗CTLA4、PD-1單抗的臨床試驗中提取生存信息、SNP array （單核苷酸多態(tài)性微陣列）、WES（全外顯子組測序）和RNA測序的數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行挖掘，提取HLA allele（人類白細胞抗原等位基因）、克隆或亞克隆的突變信息，由新抗原和腫瘤-種系抗原（ CGAs ）組成的腫瘤抗原基因組信息，還有TILs和免疫表型信息。TILs，腫瘤浸潤淋巴細胞的信息是通過GSEA和反褶積兩種方法從基因表達數(shù)據(jù)中估計。免疫表型，使用TILs和預(yù)先確定的基因集(MHC分子、免疫刺激因子和免疫抑制劑)來定義。分析的結(jié)果放在可通過網(wǎng)絡(luò)訪問的數(shù)據(jù)庫The Cancer Immunome Atlas（TCIA）中。

免疫相關(guān)特征數(shù)據(jù)處理過程

免疫相關(guān)的特征數(shù)據(jù)來源于純化的免疫細胞，正常組織和腫瘤細胞系的表達譜，并用TCGA RNA測序數(shù)據(jù)的基因集富集分析（GSEA）后得到，分析的結(jié)果放在TCIA數(shù)據(jù)庫中。

免疫浸潤的細胞特征揭示了與不同腫瘤的預(yù)后相關(guān)的細胞類型

腫瘤浸潤免疫細胞類型與預(yù)后的關(guān)系。

如A圖示ssGSEA作的氣泡圖，圖中展示了19種實體瘤的免疫細胞亞群。最上面這排是19種實體瘤，左邊是縮寫，右邊圖例顯示他們的全稱，最左邊這列是免疫細胞亞群。其中圓圈的大小指其中富集的樣本量大小，藍色表示與生存期呈正相關(guān)，紅色表示與生存期呈負相關(guān)。不難發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤中，與生存相關(guān)的細胞結(jié)構(gòu)是不同的。 一般而言，與適應(yīng)性免疫相關(guān)的許多TIL亞群的浸潤與良好的預(yù)后相關(guān)，比如活化的CD8 + T細胞，Tcm （central memory）（中樞記憶）和Tem（effector memory）（效應(yīng)記憶） CD8 +細胞和Tem CD4 +細胞， 而MDSC（骨髓源性抑制細胞）和Tregs（調(diào)節(jié)性T細胞）與不良預(yù)后相關(guān)。

突變負荷和組織環(huán)境決定免疫浸潤細胞的組成

突變負荷對免疫浸潤細胞組成的影響
如圖所示，從左到右將腫瘤分為高突變負荷、中突變負荷、低突變負荷三組，藍色是指免疫細胞富集，黃色指免疫細胞耗竭。具有高突變負荷的腫瘤富含活化的T細胞和Tem （效應(yīng)記憶）細胞，免疫抑制性Tregs （調(diào)節(jié)性T細胞）和MDSC （骨髓源性抑制細胞）呈衰竭狀態(tài)；而具有低突變負荷的腫瘤顯示相反趨勢，富集免疫抑制性Tregs （調(diào)節(jié)性T細胞）和MDSC （骨髓源性抑制細胞）細胞，活化的T細胞和Tem （效應(yīng)記憶）細胞呈衰竭狀態(tài)。

在特定腫瘤中，不同突變組的TIL組成不同。

這里最左邊的三個分組分別是高突變、中突變和低突變負荷組，最上面這行指的是19個腫瘤，可以發(fā)現(xiàn)，在同一個腫瘤中，在不同突變負荷組內(nèi)，TIL的組成是不同的。

和前面的圖類似，這里分析的是在腫瘤中富集的免疫細胞亞群，在不同突變負荷組內(nèi)的TIL組成情況。在各個腫瘤中富集的免疫細胞亞群，在不同突變負荷組內(nèi)的TIL組成也是不同的。

使用降維技術(shù)分析肺腺癌中淋巴細胞亞群， （左圖）用平均歸一化富集評分[NES] 分析所有淋巴細胞類型，（右圖）用t-SNE分析選定的幾個細胞亞群，與免疫抑制相關(guān)的亞群(MDSCs （骨髓源性抑制細胞）、Tregs)與效應(yīng)因子功能相關(guān)的亞群(活化的T細胞、Tcm細胞、Tem?CD4+和CD8+細胞)在空間上是分離的。

在腫瘤進展的不同階段有不同的免疫細胞浸潤模式。

基于來自GSEA的NES評分計算的腫瘤I期至IV期腫瘤的免疫細胞類型的富集（藍色）和耗竭（黃色）情況的火山圖。藍色代表細胞富集，黃色代表細胞耗竭。Tem?CD8+T細胞在I期和II期腫瘤中富集，在III期和IV期腫瘤中是耗竭的。相反，Tregs和MDSCs在早期腫瘤中減少，在晚期腫瘤中增加。相應(yīng)的，與適應(yīng)性免疫相關(guān)的TIL亞群的富集從I期降至IV期，而與固有免疫相關(guān)的TIL的富集從I期增加至IV期。這表明免疫細胞成分在腫瘤進展過程中向免疫抑制表型轉(zhuǎn)移。

這些分析表明，基因組譜和特定的組織背景都對免疫浸潤的細胞組成有影響。同時，這個研究結(jié)果也支持了腫瘤進展過程中免疫系統(tǒng)也在進化這個觀點。

CGAs與CD4+和CD8+T細胞浸潤相關(guān)

腫瘤抗原有可能引發(fā)腫瘤特異性的免疫反應(yīng)，主要由CGAs和新抗原構(gòu)成。 CGAs是一種通常由生殖系細胞表達但在腫瘤細胞中有異常表達的蛋白，而新抗原則是由基因編碼序列的突變或重新排列引起的。上圖為從CT數(shù)據(jù)庫（www.cta.lncc.br）獲得的腫瘤種系抗原（CGAs）列表。這些CGAs中很多抗原的腫瘤特異性比較低，所以作者選擇了60個根據(jù)以前的報道，可能被T細胞靶向攻擊的CGAs進行分析。

CGAs與實體瘤中Tem和/或Tcm CD8+?/CD4+細胞的活化顯著相關(guān)。

據(jù)既往研究我們可以知道，細胞溶解活動和細胞表面表達的CGAs數(shù)量之間沒有明確的正相關(guān)關(guān)系，即不是腫瘤細胞表面的CGAs（腫瘤-種系抗原）數(shù)量越多，腫瘤細胞越容易死亡。本文中，作者研究了CGA和T細胞活化之間的關(guān)系。
圖中右邊指與CD8 +和/或CD4 + T細胞相關(guān)的腫瘤 - 種系抗原（CGAs），最上面橫坐標(biāo)指各個腫瘤類型。藍色方塊顯示CGAs與相應(yīng)的腫瘤類型顯著相關(guān)，右邊CAG名稱后面括號里的數(shù)值是指，與這個CAG有顯著相關(guān)性的腫瘤的數(shù)量，比如第1個CSAG2這個CAG，與他顯著相關(guān)的腫瘤數(shù)量最多，有11個。在這里，作者指出了很多個與每種實體瘤中活化的，Tem和/或Tcm CD8 + / CD4 +T細胞顯著相關(guān)的CGA。

CGA評分與腫瘤間的突變負荷呈正相關(guān)。

這些在腫瘤中高表達的CGAs其實就是潛在的免疫治療靶點。作者預(yù)測了這些CGAs中與HLA分子結(jié)合的肽段，從而產(chǎn)生5775個獨特的肽段。 然后，通過計算CGA表達評分(實驗程序)來估計抗原載量。上圖對CGA表達評分和腫瘤突變的關(guān)系進行了分析，橫坐標(biāo)是各個腫瘤，按腫瘤突變負荷從低到高排列；縱坐標(biāo)是CGA表達評分。

新抗原景觀多樣而稀疏

新抗原的數(shù)量與突變負荷相關(guān)。

橫坐標(biāo)指各個腫瘤，從左到右腫瘤突變負荷越來越高，縱坐標(biāo)指新抗原的數(shù)量，很明顯，新抗原的數(shù)量和腫瘤突變負荷呈正相關(guān)。

每個突變產(chǎn)生的新抗原數(shù)量因腫瘤而異。

橫坐標(biāo)也是指各個腫瘤，縱坐標(biāo)是新抗原和突變數(shù)的比值，即每個突變產(chǎn)生的新抗原數(shù)量；圖中可見各個腫瘤中，每個突變產(chǎn)生的新抗原數(shù)量是不一樣的，范圍從黑色素瘤[SKCM]的0.93到腎細胞癌[KIRC]1.43不等。腫瘤之間的這些差異可能是由突變過程的差異導(dǎo)致。

前面這一系列的實驗說明，新抗原負荷以及CGA負荷和選定基因和免疫細胞亞群之間的關(guān)系在不同腫瘤中不是固定不變，而是高度可變的，這說明免疫應(yīng)答可能受這兩種抗原的聯(lián)合作用控制。

不同腫瘤階段的新抗原負荷。

這里展示的是不同腫瘤階段的新抗原負荷，出乎意料的是，所有腫瘤從I期到IV期的新抗原載量僅僅是略有增加。

實體腫瘤中共有的新抗原。

此圖展示的是實體瘤中各個患者共有的新抗原情況，方塊僅顯示在至少5％的腫瘤患者中共有的新抗原。THCA、PAAD、SKCM腫瘤患者中新抗原共享稍多，其他腫瘤中共享的抗原較少。所以，總體而言，新抗原很少在患者之間共享。

HLA（人類白細胞抗原）分層的共享新抗原。

最上面是各個類別的HLA，最右邊是各種新抗原。作者分析了911,548種獨特的新抗原中的共享新抗原，只有圖中展示的24種新抗原在至少5%的一種或多種腫瘤患者中共享。 我們可以發(fā)現(xiàn)，最常見的新抗原是由PIK3CA 、 RAS和BRAF等驅(qū)動基因突變引起的。其中，只有兩種新抗原在一種腫瘤類型中超過15%的患者中共享：KIGDFGLATEK在甲狀腺癌(THCA)和SKCM中的共享，KLVVVGADGV在PAAD中的共享。因此，新抗原是高度稀疏的，很少在腫瘤患者中共享。

腫瘤的基因型決定免疫表型和腫瘤逃逸機制

從前面的研究可以知道，高突變負荷的腫瘤中，效應(yīng)T細胞富集可能是抗原負荷較高導(dǎo)致的。作者進一步提出，免疫表型與描述腫瘤基因組復(fù)雜性的其他基因組特征，比如腫瘤異質(zhì)性（高與低）和抗原性（高與低）之間有沒有關(guān)系，如果有，其中有著什么樣的關(guān)聯(lián)。

異質(zhì)性強的腫瘤突變負荷略低，但富含活化的T細胞和Tem細胞，并且免疫抑制細胞耗竭。

類似的，新抗原頻率較高的腫瘤突變負荷略低，富含活化的T細胞和Tem細胞，并且免疫抑制細胞呈耗竭狀態(tài)。

THCA的基因型與特異性免疫表型相關(guān)。

作者選擇了具有最低和最高突變負荷的兩種腫瘤，即THCA和SKCM兩種腫瘤，并分析了它們在不同基因型中的免疫表型。上圖示THCA腫瘤中，BRAF-和RAS-突變的免疫細胞組成的情況。最上面的圖例指BRAF-和RAS-突變兩種基因型分類，右邊是免疫細胞。從圖中可見，在THCA腫瘤中，不同的基因型中免疫的細胞組成不同，即免疫表型不同。

不同的基因突變表現(xiàn)出明顯不同的免疫浸潤細胞模式。

基于來自GSEA的NES評分計算的火山圖，顯示TCHA腫瘤中，BRAF-與RAS-突變時免疫細胞浸潤的情況。以BRAF突變?yōu)橹鲿r，MDSC等與免疫抑制相關(guān)的細胞富集，Tem等等與免疫活化相關(guān)的細胞呈衰竭狀態(tài)。

在BRAF-和RAS-突變的TCHA腫瘤中MHC和免疫調(diào)節(jié)分子的表達。

其中， BRAF突變的腫瘤主要浸潤免疫抑制細胞，而RAS突變的腫瘤則下調(diào)MHC分子和免疫調(diào)節(jié)分子。這說明MHC、免疫刺激分子和免疫抑制分子的表達水平也與基因型有關(guān)，提示BRAF突變和RAS突變的THCA腫瘤有不同的腫瘤逃逸機制。

SKCM腫瘤中，基因型與不同的免疫表型相關(guān)。

圖4（I）基于來自GSEA的NES得分計算的SKCM腫瘤中，各基因型細胞浸潤情況的火山圖。同樣的，不同基因型中免疫細胞的浸潤情況也是不一樣的，比如BRAF型的腫瘤富含效應(yīng)T細胞，而其他基因型富含Treg等免疫抑制細胞。

SKCM腫瘤不同基因型的新抗原負荷（突變負荷）。

在SKCM隊列中，不同基因型腫瘤的新抗原負荷不同，因此作者推測突變負荷可能也會對免疫浸潤情況產(chǎn)生影響。

同樣的，SKCM腫瘤中，四種基因型與MHC和免疫調(diào)節(jié)分子表達情況也有明顯差異。

以上的這些研究結(jié)果提示腫瘤的基因型決定了免疫表型和腫瘤的逃逸機制。

機器學(xué)習(xí)確定了實體瘤中腫瘤免疫原性的主要決定因素

腫瘤與各類免疫相關(guān)的因素的關(guān)系。

這里分析了各種免疫相關(guān)因素和腫瘤的關(guān)系，免疫相關(guān)因素指左邊這一列，作者將免疫相關(guān)因素分為四類，包括:(1) ?MHC?I類、II類、非經(jīng)典分子的表達; (2)某些共抑制和共刺激分子的表達；（3）活化的CD8?+/CD4+?T細胞和Tem?CD8+?/CD4+細胞浸潤; (4)免疫抑制細胞(Tregs和MDSCs)浸潤。

免疫表型圖

免疫表型評分與12種實體瘤的生存相關(guān)

作者根據(jù)免疫表型圖中代表性基因或基因組的表達計算了一個綜合評分，即免疫表型評分。分析顯示，免疫表型評分與12種實體瘤的生存相關(guān)，其中4種腫瘤具有顯著相關(guān)性：KIRC、SKCM、乳腺癌(BRCA)、膀胱癌(BLCA)。

免疫表型評分預(yù)測CTLA-4和PD-1阻滯劑的治療效果

抗CTLA-4抗體治療個體患者的免疫表型圖

在此研究的患者中，與腫瘤內(nèi)的平均表達相比，MHC上調(diào)，顯示為紅色，CP部分下調(diào)，顯示為藍色。但是有效和無效的患者MHC上調(diào)和CP下調(diào)的程度是不一樣的，顏色深淺不同。

抗CTLA-4抗體治療個體患者中，對免疫治療有反應(yīng)的患者細胞毒細胞(CD8+T細胞、Tγδ細胞、NK細胞)富集，和免疫抑制相關(guān)的MDSCs和Tregs呈耗竭狀態(tài)。

應(yīng)答者和非應(yīng)答者的免疫表型評分明顯不同。

縱軸指免疫表型評分，橫軸根據(jù)對免疫治療的反應(yīng)情況分成3個色塊，從圖中可見，應(yīng)答者和非應(yīng)答者的免疫表型評分明顯不同，這使從免疫表型圖分析得出的免疫表型評分能夠區(qū)分對免疫治療有效和無效的患者。

IPS（免疫表型評分）對于治療有效率具有更好的預(yù)測能力

抗PD-1免疫治療的患者中，免疫原性的決定因素在反應(yīng)者和非反應(yīng)者兩組人群中表現(xiàn)出不同的表達模式。

抗PD-1免疫治療的患者中，有效者的腫瘤富含細胞毒性細胞（CD8 + T細胞，Tgd細胞，NK細胞）并耗盡MDSC和Tregs。

抗PD-1免疫治療的患者中，免疫表型評分可以將對免疫治療有無應(yīng)答的患者進行分層。

IPS（免疫表型評分）對抗PD-1抗體治療的患者也有較好的預(yù)測能力。