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2.41.1 用具的準(zhǔn)備
(1) 180度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時(shí)。
(2) 電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用雙氧水浸泡過夜，用DEPC水沖洗，干燥備用。
(3) 處理DEPC水(2 L)備用。
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(4) 用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染
用RNAZap擦洗梳子，電泳槽，刀片等，然后用DEPC水沖洗二次，去除RNAZap。
2.41.2 制膠
(1) 稱取0.36mg 瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波爐加熱至瓊脂糖完全熔解。60℃空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分)。
(2) 在通風(fēng)廚中加入3.6ml的10*Denaturing Gel buffer，輕輕振蕩混勻。注意盡量避免產(chǎn)生氣泡。
(3) 將熔膠倒入制膠板中，插上梳子。如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或?qū)馀萃频侥z的邊緣。注：膠的厚度不能超過0.5cm。
(4) 膠在室溫下完全凝固后，將膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1cm，小心拔出梳子。(配制250ml 1*MOPS Gel Running buffer，在電泳過程中補(bǔ)充蒸發(fā)的buffer。)
(5) 檢查點(diǎn)樣孔。
2.41.3 RNA樣品的制備
在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當(dāng)?shù)腅B(終濃度為10ug/ml)。混勻后，65℃空氣浴15min。短暫低速離心后，立即放置于冰上5min。
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2.41.4 電泳
(1) 將RNA樣品小心加到點(diǎn)樣孔中。
(2) 在5V/cm下跑膠(5x14cm)。在電泳過程中，每隔30min短暫停止電泳，取出膠，混勻兩極的電泳液后繼續(xù)電泳。當(dāng)膠中的溴紛藍(lán)(500bp)接近膠的邊緣時(shí)終止電泳。
(3) 紫外燈下，檢驗(yàn)電泳情況，并用尺子測量18S、28S、溴紛藍(lán)到點(diǎn)樣孔的距離。注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時(shí)間。
2.41.5 轉(zhuǎn)膜
(1) 用3%雙氧水浸泡真空轉(zhuǎn)移儀后，用DEPC水沖洗。
(2) 用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏，用DEPC水沖洗二次。
(3) 連接真空泵和真空轉(zhuǎn)移儀，剪取一塊適當(dāng)大小的膜(膜的四邊緣應(yīng)大于塑膠屏孔口的5mm)，膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后，放置在多孔滲水屏的適當(dāng)位置。
(4) 蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣上鎖。
(5) 將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔，并至少蓋過邊緣約2mm，以防止漏氣。
(6) 將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不能有氣泡。
(7) 打開真空泵，使壓強(qiáng)維持在50~58mbar;立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔10min在膠面加上1ml transfer buffer，真空轉(zhuǎn)移2小時(shí)。
(8) 轉(zhuǎn)膜后，用鑷子夾住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中輕
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輕泡洗10秒，去除殘余的膠和鹽。
(9) 用吸水紙吸取膜上多余的液體后，將膜置于UV交聯(lián)儀中自動(dòng)交聯(lián)。
(10) 將膠和紫外交聯(lián)后的膜，在紫外燈下檢測轉(zhuǎn)移效率。(避免太長的紫外曝光時(shí)間)
(11) 將膜在-20℃保存。
2.41.6 探針的制備
(1) 在1.5ml離心管中配制以下反應(yīng)液：
模板DNA(25ng) 1ul
Random Primer 2ul
滅菌水 11ul
總體積： 14ul
(2) 95°C加熱3分鐘后，迅速放置于冰冷卻5min。
(3) 在離心管中按下列順序加入以下溶液：
10×Buffer 2.5ul
dNTP Mixture 2.5ul
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul
Exo-free Klenow Fragment 1 ul
(4) 混勻后(25ul)，37°C下反應(yīng)30分鐘。短暫離心，收集溶液到管底。
(5) 65°C加熱5min使酶失活。
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2.41.7 探針的純化
(1) 準(zhǔn)備凝膠：將1g凝膠加入30ml的DEPC水中，浸泡過夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠數(shù)次，以除去可溶解的葡聚糖。換用新配制的TE(PH7.6)。
(2) 取1ml一次性注射器，去除內(nèi)芯推捍，將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住，在注射器中裝填Sephadex G-50凝膠。
(3) 將注射器放入一支15ml離心管中，注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘，凝膠壓緊后，補(bǔ)加Sephadex G-50凝膠懸液，重復(fù)此步直至凝膠柱高度達(dá)注射器0.9ml刻度處
(4) 100ul STE緩沖液洗柱，1600g離心4min。重復(fù)3次。
(5) 倒掉離心管中的溶液后，將一去蓋的1.5ml離心管置于管中，再將裝填了Sephadex G-50凝膠的注射器插入離心管中，注射器口對(duì)準(zhǔn)1.5ml離心管。
(6) 將標(biāo)記的DNA樣品加入25 ul STE，取出0.5ul點(diǎn)樣于DE8 paper上，其余上樣于層析柱上。
(7) 1600g離心4min，DNA將流出被收集在去蓋的離心管中，而未摻入DNA的dNTP則保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點(diǎn)樣于DE8-paper。
(8) 測比活性(試劑比活要求:106cpm/ml)。
2.41.8 預(yù)雜交
(1) 將預(yù)雜交液在雜交爐中68℃預(yù)熱，并漩渦使未溶解的物質(zhì)溶
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解。
(2) 加入適當(dāng)?shù)腢LRAhyb到雜交管中(以100cm2 膜面積加入10mlULRAhyb雜交液)，42℃預(yù)雜交4 hr。
2.41.9 探針變性
(1) 用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。
(2) 90℃熱處理稀釋后探針10min后，立即放置于冰上5min。
(3) 短暫離心，將溶液收集到管底。
2.41.10 雜交
(1) 加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中，混勻后，將探針加到預(yù)雜交液中。
(2) 42℃雜交過夜(14~24hr)。雜交完后，將雜交液收集起來于-20℃保存。
2.41.11 洗膜
(1) 低嚴(yán)緊性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液)，室溫下，搖動(dòng)洗膜5min兩次。
(2) 高嚴(yán)緊性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液)，42℃ 搖動(dòng)洗膜20min兩次。
2.41.12 曝光
(1) 將膜從洗膜液中取出，用保鮮膜包住，以防止膜干燥。
(2) 檢查膜上放射性強(qiáng)度，估計(jì)曝光時(shí)間
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(3) 將X光底片覆蓋與膜上，曝光
(4) 沖洗X光底片，掃描記錄結(jié)果。
2.41.13 去除膜上探針
將200ml 0.1%SDS(由DEPC水配制)煮沸后，將膜放入，室溫下讓SDS冷卻到室溫，取出膜，去除多余的液體，干燥后，可以保存幾個(gè)月。
2.41.14 雜交結(jié)果
操作應(yīng)該小心，但不必緊張。用于RNA電泳、轉(zhuǎn)膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse 酶，以免樣品的降解。轉(zhuǎn)膜時(shí)，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡。
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