RNA抽提
一，準(zhǔn)備工作
1， 實(shí)驗(yàn)器具與材料：
（1） 移液槍：1ml、200ul、10ul
（2） 吸頭：1ml、200ul、20ul
（3） 吸頭臺(tái)：放置1ml吸頭的一個(gè)，放置200ul和20ul的吸頭一個(gè)
（4） EP管1.5ml、100ul
（5） 玻璃研磨器
（6） 容量瓶：1000ml
（7） 鹽水瓶：100ml
（8） 15ml塑料管一個(gè)（配75％乙醇用）
2， 實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備
（1） 塑料制品：（包括吸頭、EP管等）
將塑料制品逐個(gè)浸泡于1‰DEPC水中（必要時(shí)小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過(guò)夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時(shí)左右烘干），試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺(tái)。
（2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）
先泡酸過(guò)夜，沖洗干凈后，在1‰DEPC水中泡8小時(shí)左右，37℃烘干，用蒙錫紙包裹送至干烤3次。
（3） 金屬制品：（鑷子等）
先洗干凈，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）
3， 試劑配制和準(zhǔn)備：
（1） DEPC水：泡實(shí)驗(yàn)器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)后備用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過(guò)夜，送至高壓。
（2） 75％乙醇（要在抽提時(shí)現(xiàn)配）：用無(wú)水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:無(wú)水乙醇＝1:3），然后放于-20℃?zhèn)溆谩?br data-filtered='filtered'>（3） 異丙醇：放入棕色瓶
（4） 氯仿：放入棕色瓶
（5） Trizol：100ml/瓶 存放于4℃
二，抽提時(shí)注意事項(xiàng)：
全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤換，避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。
三，抽提步驟
1． 勻漿化作用
取約100mg鼠腦組織放于玻璃研磨器內(nèi)，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨組織后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器內(nèi)加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。顛倒混勻10下，室溫靜置5分鐘。
2． 分離階段
每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒，使其充分混勻，室溫靜置5分鐘。后12000rmp離心15分鐘。
3． RNA的沉淀
將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中（約400-500ul），加入0.5ml異丙醇，混勻后放于-20℃中1小時(shí)，后12000rmp離心10分鐘。
3
4． RNA的洗脫
小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml現(xiàn)配的75%的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌RNA沉淀一次，后7500rmp離心5分鐘。
5． RNA的再溶解
小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺(tái)開(kāi)風(fēng)機(jī)吹干（約30分鐘，此時(shí)RNA沉淀變透明）。注意不能讓RNA沉淀完全干燥（會(huì)極大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分鐘助溶。
6，RNA的保存
提取的RNA保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。
TRIzol法抽提總RNA
細(xì)胞1×107
組織100mg
↓
加1mlTRIzol
細(xì)胞用1ml加樣器吹至液體澄清且無(wú)細(xì)胞團(tuán)塊
↓
勻漿（要徹底，后轉(zhuǎn)至EP管）
（組織勻漿量>100mg時(shí)分裝1ml/每EP管）
↓
顛倒混勻10下，室溫5分鐘
↓
加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）
↓
顛倒混勻15S，室溫5分鐘
↓
4℃，離心12000rmp，15分鐘
↓
轉(zhuǎn)上層水相（約400-500μl）于另一新1.5mlEP管中
↓
加等體積異丙醇（約400 -500μl），混勻后-20℃中1小時(shí)
↓
4℃，離心12000rmp，10分鐘
↓
棄上清
↓
加冰預(yù)冷的75%乙醇（用高壓后的DEPC水配）1ml
↓
4℃離心7500rmp，5分鐘
↓
棄上清，超凈工作臺(tái)開(kāi)風(fēng)機(jī)干燥約30分鐘（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）
↓
立即保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄
4
逆轉(zhuǎn)錄（RT）
一，準(zhǔn)備工作
1， 實(shí)驗(yàn)器具與材料：
（1）移液槍：200ul、10ul
（2）吸頭：200ul、20ul
（3）EP管1.5ml、100ul
（4）水浴箱
2，實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備
塑料制品：（包括吸頭、EP管等）
將塑料制品逐個(gè)浸泡于1‰DEPC水中（必要時(shí)小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過(guò)夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時(shí)左右烘干），試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺(tái)。
3，試劑配制和準(zhǔn)備：
（1）DEPC水：泡實(shí)驗(yàn)器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)后備用。逆轉(zhuǎn)錄中所用的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過(guò)夜，送至高壓，后分裝到幾個(gè)1.5mlEP管中，-20℃中保存?zhèn)溆谩?br data-filtered='filtered'>（2）RT中所需要的各種試劑
（3）引物濃度計(jì)算方法： （新合成的引物的稀釋） 假如終濃度為X uM(pmol/ul) 加DEPC水體積（ul）＝（OD×33×1000000）/（分子量×X）
二，RT時(shí)注意事項(xiàng)：
為避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。
三，RT步驟
用SSⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RT（20ul體積）
1， 準(zhǔn)備0.65ml的EP管
2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暫離心。
3， 65℃水浴5分鐘后，立刻0℃冰水浴至少1分鐘。
4， 短暫離心后，冰上操作：加入4ul 5×First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SSⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶。
5， 短暫離心
6， 50℃水浴60分鐘進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
7， 70℃水浴15分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶
8， -20℃保存，或立即進(jìn)行PCR。
用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RT（10ul體積）
1， 準(zhǔn)備0.65mlEP管
2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA
3， 稍離心，100℃沸水裕1min
4， 加入0.5uldNTP，2ul 5×Buffer，1ul AMV逆轉(zhuǎn)錄酶
5， 稍離心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT
6， 100℃沸水裕3min滅活A(yù)MV
7， 立即PCR或-20℃保存。
5
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）
二，準(zhǔn)備工作
8， 實(shí)驗(yàn)器具與材料：
（1）移液槍：200ul、10ul
（2）吸頭：200ul、20ul
（3）吸頭臺(tái)：放置200ul和20ul的吸頭一個(gè)
（4）EP管1.5ml、100ul
2，實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備
(1) 塑料制品：（包括吸頭、EP管等）
送至高壓3次，試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺(tái)。
3, 試劑配制和準(zhǔn)備：
(1) 雙蒸水： 100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝40ml蒸餾水，送至高壓，后分裝到幾個(gè)1.5mlEP管中，-20℃中保存?zhèn)溆谩?br data-filtered='filtered'>(2) PCR中所需要的各種試劑
三，PCR時(shí)注意事項(xiàng)：
佩戴一次性手套，同時(shí)避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。
四，PCR步驟
1， 準(zhǔn)備100ul EP管
2， 依次在管中加入：（50ul反應(yīng)體系）
ddH2O 37.5ul ×？
10mM dNTP 1ul ×？
10×PCR buffer 5ul ×？
25mM Mgcl2 （加之前要搖勻） 3ul ×？
上游引物 1ul ×？
下游引物 1ul ×？
模板cDNA 1ul
3， 稍離心
4， 100℃沸水浴1分鐘
5， 趁熱加入Tag酶0.5ul（冰上操作）
6， 再加入50ul液體石蠟封閉
7， 10000rmp離心1分鐘
8， PCR條件
94℃ 1min
58℃ 50sec
72℃ 1min30sec
進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，然后72℃ 10min 完后4℃保溫。
9，10000rmp離心5min
10，將下層水相轉(zhuǎn)入新的0.65mlEP管中，-20℃保存。
6
電泳鑒定
一，準(zhǔn)備工作
1，實(shí)驗(yàn)器具與材料：
（1）移液槍：10ul
（2）吸頭：20ul
（3）吸頭臺(tái)：放置200ul和20ul的吸頭一個(gè)
（4）三角燒瓶：50ml一個(gè)
（5）瓊脂糖
2，實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備
(1) 塑料制品：（包括吸頭等）
送至高壓3次，試驗(yàn)前將槍頭放入吸頭臺(tái)。
（2）電泳板及電泳槽：
用自來(lái)水沖洗干凈備用
3, 試劑配制和準(zhǔn)備：
(1) 電泳緩沖液（TAE）：
先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液：將37.2g EDTA-Na加入160ml蒸餾水中，在攪拌器上劇烈攪拌。在用NaOH調(diào)節(jié)溶液PH值至8.0（約需4gNaOH）。用蒸餾水定容至200ml。后送至高壓滅菌。室溫保存。
再配制50×TAE溶液：在400ml蒸餾水中溶解121g Tris堿，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸餾水定容至500ml，室溫保存。
（2）瓊脂糖溶液（1.0％）：
50×TAE溶液取10ml，稀釋成500ml，取50ml溶解0.5g瓊脂糖，電爐上煮至沸騰，溶化的瓊脂物冷卻至60℃左右時(shí)加入10mg/ml EB 5ul，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的電泳板中，在室溫下放置45min左右后進(jìn)行電泳。
（3）溴化乙錠（EB）（10mg/ml）：
在20ml水中加入0.2g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)。然后用鋁箔包裹容器或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫保存。
（4）加樣緩沖液（Loading Buffer）一般為6×Loading Buffer
二，電泳鑒定時(shí)注意事項(xiàng)：
佩戴一次性手套，避免皮膚接觸EB。無(wú)路做膠還是電泳緩沖液盡量用新的，不要超過(guò)兩周。
五，電泳步驟
1， 50×TAE取10ml稀釋成500ml，取50ml溶解0.5g瓊脂糖。電爐上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入電泳槽中。
9， 用透明膠封閉電泳板，瓊脂糖溶液冷卻至溫?zé)釙r(shí)，倒入帶梳子的電泳板中，冷卻后，拔出梳子，放入電泳槽中。
10， 加樣：PCR Marker：1ul Marker＋1ul Loading Buffer＋4ul TAE混勻于塑料膜上，加入孔中。PCR樣品：5ul 樣品DNA＋1ul Loading Buffer 混勻后依次加入孔中。
11， 接上電源，電壓120V，電流50mA進(jìn)行電泳。
12， 電泳約1小時(shí)后，紫外燈檢測(cè)。