概觀miRNA

MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼的小RNA分子，通過與靶RNA的3?UTR互補或部分互補結合，使其降解或介導其翻譯抑制，參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育、腫瘤轉移等多種生物學過程.miRNAs基因通常位于基因間或編碼蛋白基因的內含子中，在核內由RNA聚合酶II或III轉錄產(chǎn)生具有特征性莖環(huán)結構的pri-miRNA,然后在Drosha-DGCR8復合體的作用下，剪接成70nt的pre-miRNA,它由exportin5由核內運到胞漿。在胞漿內，pre-miRNA在Dicer酶作用下剪切成22bp的成熟雙鏈miRNA,其中的一條鏈與RISC結合而參與基因轉錄后水平的調控。

根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫，目前所發(fā)現(xiàn)的miRNAs已超過700個，隨著高通量測序的應用，將會有更多的新的miRNAs被發(fā)現(xiàn)?？赡芙?0%的人類基因受到miRNAs調控，然而，當過表達或抑制某一個miRNA時，在發(fā)生調變的眾多基因當中尋找并鑒定其中起關鍵作用的靶基因仍然具有相當大的挑戰(zhàn)。目前鑒定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息學軟件預測，結合基因芯片分析以及生物學實驗方法來研究miRNA的功能及尋找其中起重要作用的靶基因。此外，利用蛋白質質譜來尋找miRNA靶基因也成為一種新的途徑。

microRNA的篩選

miRNA的實驗驗證

為了進一步驗證miRNA在組織細胞內的表達，目前常用來檢測miRNA的技術主要有以下幾種：Northern雜交;原位雜交; Stem-loop實時定量RT PCR.這三種技術各有利弊，可以相互結合應用，來反映細胞內miRNA的真實表達水平。

1. Northern雜交

   MicroRNA是一類很小的分子，部分microRNA表達水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法來定量研究有一定困難，特別是重復性較差，步驟繁瑣等。目前多數(shù)研究人員采用Northern Blot，它是一種重復性好、靈敏高、直接的方法,可以用來檢測microRNA的存在、表達量的變化等。而由于放射污染等原因，同位素標記的探針的使用有一定的局限性。而Exiqon公司推出的鎖核苷酸（locked-nucleic acid, LNA）探針，具有穩(wěn)定性高、特異性好、無放射污染等優(yōu)點，成為新的Northern Blot檢測探針。

   基本原理：將待檢測的RNA分子變性后，通過尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離,繼而按其在凝膠中的位置轉移到尼龍膜上，固定后再與同位素、地高辛或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。

   用途：檢測樣品中的RNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點突變、擴增重排等。

   實驗過程

   1. 提前配制無APS和TEMED的15%的Ura-PAGE膠的混合液，即

      50ml of Pre-Gels：

      1. Urea: 24 g
      2. 40% Acrylamide: 18.75 mL
      3. 5x TBE Buffer: 10 mL
      4. ddH20: 0 mL
   2. 器皿的清洗：器皿同Western Blotting裝置。
      1. 用清水沖洗干凈，乙醇擦干3%；
      2. H2O2 填充浸泡電泳槽、玻璃片、梳子10分鐘；
      3. 用0.1% DEPC處理過的水沖洗電泳槽，梳子和玻璃片。
      4. 用RNAase Away 擦海綿和其他相關器材。
      5. 安裝配膠裝置。
   3. 配膠：取10 ml Pre-Gels，加入33.3- 45 ul的APS 和 10-20ul的TEMED，混勻，加入玻片中，加入10或15齒梳子。大約30-60 min 即可凝好。
   4. RNA樣品的準備

      Small RNAs（大約107細胞） （或者Total RNA ~20-200ug） 在 ~18ul DEPC H2O 加入 2ul 10xRNA loading buffer。 95℃加熱 5min, 冰上冷卻。 瞬時離心收集RNA樣品。

   5. 電泳：（裝置同Western Blotting電泳裝置），電泳液1xTBE。

      15% Urea-PAGE 在電泳液 1xTBE進行電泳。電壓180V 直到溴芬蘭到達膠的底部。根據(jù)Ambion公司的步驟，在上樣之前，300V 預電泳10min（防止膠漏同時活化膠），然后用電泳液1xTBE沖洗孔，將尿素沖出后然后小心、迅速加樣。選用的是Roche公司提供的LNA-labeled DNA作為對照，同時將自己合成的RNA Oligo作為陽性對照（總量為1 pmol即可）。其中溴芬蘭的對應的分子量為13nt左右，二甲苯青FF對應的為40 nt左右。

   6. 轉膜（裝置同Western Blotting轉膜裝置），轉膜液為0.5?TBE。
      1. 將膠浸泡在0.5?TBE大約 10min 。
      2. 用EtBr （0.5ug/ml）染膠10min 后，用紫外凝膠觀測RNA電泳情況(參考Ambion公司的條帶分析)。用0.5?TBE 洗膠 5min.
      3. 用鉛筆標記好轉膜的面，將 Nylon membrane（GE公司）和兩片厚濾紙浸泡在 0.5?TBE 大約10min.
      4. 制備凝膠、膜夾層。將濾紙、膠、膜、濾紙形成三明治結構，注意膠應該靠近陰極側。注意每層間不能有氣泡。
      5. 裝配好轉膜裝置，裝置同Western Blotting轉膜裝置。
      6. 于冰上300mA轉膜 1 h。
      7. 把膜（RNA 面朝上）放在紫外交聯(lián)儀中使用4000J UV進行交聯(lián).
      8. 將膜夾在厚的濾紙中間，80℃烘烤0.5-2 h，可以輕壓，以防止膜發(fā)生翻卷。
      9. 如果可以直接做，則放在室溫即可；也可以儲存在4?C ，直到使用（可儲存6個月）。
      10. 亞甲藍（methylene blue）染色 3~5min, 在可見光下 黃色濾光片對膜照相。
   7. 雜交
      1. 在雜交爐中37- 42℃ 在雜交液（7% SDS， 0.2M Na2HPO4）中預雜交1h , 然后將膜放入雜交袋，然后加入配好濃度的Dig-Labeled probe，在雜交爐中37- 42℃雜交過夜。

         Dig-Labeled probe使用濃度：將10ul的25uM的公司原液稀釋十倍后分裝儲存，取儲存probe液（2.5uM）20ul/6ml（U6內參）或2.7-27ul儲存液/10ml雜交液（根據(jù)miRNA的量或豐度定）。

      2. 37- 42℃洗膜液（2×SSC，0.1%SDS）洗膜三次，每次15min。
      3. 室溫MABT（0.1M Maleic Acid， 0.15M Nacl，0.3% Tween-20 ，PH7.5）洗膜三次，每次5min。
      4. 室溫用Blocking Solution (用MAB 10倍稀釋10×Blocking Solution)封閉 1h 。
      5. 室溫加入anti-Dig antibody 40 min (1:10000-1:5000 in Blocking Solution)。注意：抗體用之前，應該以12000g速度離心5 min。
      6. 用MABT液洗膜兩次，每次15 min。
      7. 膜在Detection buffer（ 0.1 M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5）中平衡5 min。
      8. 配CSPD液（1：100 Detection Buffer），有RNA的膜面向上放入雜交袋中，加入1ml 配好的CSPD液，擠出氣泡，封口，孵育5 min.
      9. 擠出CSPD液，封口，37℃孵育5-15 min。
      10. 曝光2 min~1h (根據(jù)情況定)。一般內參U6在5分鐘內即可顯影。

   實驗注意事項

   1. 配膠時，由于濃度較大，所以尿素比較難溶，尿素的溶解不能加熱，可以采用振蕩或顛倒離心管；配好的無APS和TEMED的15%的Ura-PAGE膠可以儲存在室溫或4℃冰箱中（可儲存1個月左右）。
   2. 電泳前，應該按照步驟將裝置盡量進行RNAase free處理。
   3. RNA上樣前，300V 預電泳10min（防止膠漏，同時活化膠），然后用電泳液 1xTBE沖洗孔，將尿素沖出后然后小心、迅速加樣。此操作需要一定的訓練，因為加樣孔中很快會析出尿素，一旦有尿素析出對RNA電泳的形態(tài)會有一定的影響。
   4. LNA探針使用前進行分裝，然后凍存于-70℃冰箱中。
   5. 不同miRNA雜交的溫度和時間不同，需要進行條件的摸索。一般內參溫度 為42℃。
   6. 尼龍膜紫外交聯(lián)和烘烤后，可以在4℃冰箱中保存半年以上。

2. 原位雜交

   原位雜交分為細胞和組織內原位雜交，該技術檢測miRNA表達，可更直觀的展示出miRNA的時空表達模式。它不僅可以檢測不同細胞系單個細胞中的miRNA表達，還可在不經(jīng)分類和分離的情況下，比較不同細胞系中miRNA的表達水平。它是分析miRNA表達組織和時序特異性的有力工具。

3. Stem-loop實時定量RT PCR

   傳統(tǒng)實時定量RT PCR只能檢測到miRNA前體，而Stem-loop實時定量RT PCR技術可以解決這一問題。Stem loop實時定量RT PCR是一項高特異度、敏感度的檢測miRNA表達的實驗技術，包括設計具有莖環(huán)（stem loop）結構的反轉錄引物和用miRNA熒光標記的特異分子探針進行實時PCR 二個關鍵步驟。該技術具有以下優(yōu)點:高度特異性，對序列高度同源的miRNA也可精確區(qū)分；超寬的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度；樣品消耗少，僅需1～10 ng的總RNA；適用范圍廣，總RNA 、細胞裂解物以及純化的RNA都可用于miRNA的定量檢測。

   Stem-loop實時定量RT PCR基本原理： microRNA的RT-PCR一般使用莖環(huán)結構的引物，這種具有莖環(huán)結構的引物針對所需檢測的目的microRNA設計，具有特異的序列，結構示意圖如下所示。內參使用的是小RNA U6，U6的反轉錄使用的是隨機引物。將反轉錄的產(chǎn)物作為real-time PCR的模板，檢測目的microRNA的引物是針對目的microRNA的特異的上下游引物，檢測內參使用的是針對U6的特異的上下游引物。

   實驗過程

   1. 用Trizol抽提t(yī)otal RNA，抽提方法同普通的RNA的Trizol抽提，只是在用異丙醇處理時需要4℃ 過夜。將抽提得到的RNA置于－80℃保存。
   2. 將抽提的RNA進行反轉錄。反轉錄的體系一般使用12.5ul的體系。具體的體系如下：
      1. RNase free water
      2. Total RNA: 0.625ug
      3. Impron buffer: 2.5ul
      4. dNTPs: 2.5ul
      5. RNase inhibitor: 0.625ul
      6. Impron Mgcl2: 1.5ul
      7. Primer: 0.5ul
      8. Reverse transcriptase: 0.625ul

      具體的操作是事先計算好需要的模板量，以及所要的RNase free water的量，在PCR小管中加好需要的模板量以及RNase free water的量，并將剩下的模板立即置于－80℃保存。再按照反轉錄的體系做好總的MIX，再分裝到每個PCR小管內。將PCR小管置于PCR儀上反轉，反轉的具體程序如下： 25℃ 5 min ,42℃ 60 min ,70℃ 15 min. 4℃儲藏

   3. 反轉錄的cDNA作為real-time PCR檢測的模板，由于real-time PCR檢測靈敏性，要求每個樣需要三個重復。每一個反應的用量如下：
      • SYBR 5.0ul
      • Primer mix 0.2ul
      • cDNA 1.0ul
      • water 3.8ul
   4. 在八連管中先加入模板，加入3.4ul的cDNA模板。
   5. 根據(jù)需要檢測樣本的個數(shù)，計算所需要的SYBR、Primer mix、water量，具體的計算過程為：試劑單反應量X檢測樣本個數(shù)X3.4 ,根據(jù)計算需要的量制作MIX 。將MIX加入每個八連管的小管中。
   6. 將對應的每個八連管的小管取出10ul加入96孔板，每個小管對應96孔板的3個孔，即3個重復孔。
   7. 加完樣品后，用專用的封膜覆蓋96孔板，用專用的刮板覆蓋嚴實。
   8. 上機檢測。具體PCR程序如下：
      1. 50℃ 2 min ;
      2. 95℃ 5 min ;
      3. 95℃ 30 s ;
      4. 60℃ 40 s ;
      5. 72℃ 30 s ;
      6. 95℃ 15 s ; 60℃ 30s ;95℃ 15 s .</OL< ol>

         實驗注意事項

         1. 由于real-time PCR的檢測十分靈敏，因此它對RNA定量的準確性要求較高，一般RNA的定量多采用3復孔定量。
         2. 無論在反轉錄或real-time PCR加樣時要求加樣一定要準確。
         3. 在將八連管的mix加入96孔板前一定要充分混勻，一般采取的策略是將八連管一剪為二，置于Vortex上振蕩混勻，Vortex的轉速不要太高，以免將管內的液體濺到蓋子內。

miRNA靶基因的尋找

miRNA靶基因的鑒定