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Western Blot 又稱為蛋白質(zhì)印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的基于抗原抗體之間特異免疫反應(yīng)的一種定量或定性檢測(cè)蛋白的實(shí)驗(yàn)方法。 其基本原理為：聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)樣品分離，分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到固相支撐物（雜交膜）上，一抗特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白，通過HRP、AP、生物素、地高辛或者熒光探針等標(biāo)記的二抗識(shí)別一抗，最終通過顯色、熒光或者化學(xué)發(fā)光等方法將目標(biāo)蛋白可視化，從而對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定性和定量分析。 Western Blot實(shí)驗(yàn)原理示意圖 良好的開始是成功的一半，充分裂解并保存良好的優(yōu)質(zhì)的蛋白樣品對(duì) Western Blot 實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。下面我們將從蛋白樣品制備的方法和試劑選擇上給大家一些建議。 一 . 了解目標(biāo)蛋白 目標(biāo)蛋白因其物種來(lái)源和組織特異性的不同，在種類和性質(zhì)上有很大差異，因此并沒有一種制備方法可以適用于所有蛋白的提取。這就需要我們進(jìn)行全面的分析后才能選擇最合適的蛋白制備方法。 首先要了解：樣品是來(lái)自什么物種？目標(biāo)蛋白定位在哪種組織或細(xì)胞器？是可溶蛋白還是不可溶蛋白？是高豐度蛋白還是低豐度蛋白？在制備時(shí)需要保持蛋白的天然活性，還是需要變性蛋白？ 其次要知道：哪種方法或試劑能夠防止蛋白降解、聚集、沉淀、變性、去修飾？哪種方法能夠去除高豐度蛋白干擾，富集低豐度蛋白？哪種能去除核酸、多糖、脂肪等雜質(zhì)？哪種方法能在有限的實(shí)驗(yàn)條件下，簡(jiǎn)便快速地獲得高純度且完整性好的蛋白？ 比如說(shuō)，有些蛋白只在特定的細(xì)胞或細(xì)胞器中以較低豐度分布，這時(shí)候可能需要分離特定的細(xì)胞或細(xì)胞器，以達(dá)到獲得的蛋白樣品可滿足WB檢測(cè)的下限；還有的蛋白在常規(guī)裂解液中易聚集或沉淀，尤其是一些多次跨膜的蛋白或核內(nèi)蛋白，這種情況下就需要大家查閱參考文獻(xiàn)來(lái)了解目標(biāo)蛋白的性質(zhì)和常用的提取方法。 對(duì)于特定組分的分離，可選用碧云天亞細(xì)胞組分分離試劑盒，相關(guān)產(chǎn)品如下：
碧云天亞細(xì)胞組分分離試劑盒 二 . 裂解液的選擇 蛋白樣品制備，首先要選擇合適的裂解液。一般裂解液包含以下幾個(gè)組分: 1. 緩沖系統(tǒng)：裂解液pH過高或過低都可能使蛋白質(zhì)變性析出或水解，因此通常采用近似生理pH的buffer來(lái)作緩沖體系。Tris-HCl緩沖液因其緩沖能力強(qiáng)，不容易與其它離子形成不溶物，且與整個(gè)電泳系統(tǒng)兼容性好，因此是裂解的首選緩沖液。 2. 鹽離子濃度：通常大家習(xí)慣以生理鹽濃度作為裂解液的鹽離子濃度。在提胞漿蛋白等易溶組分時(shí)，也有通過低鹽而實(shí)現(xiàn)低滲，從而使細(xì)胞脹破以實(shí)現(xiàn)質(zhì)膜分離的，這種情況下一般使用不超過50mM的NaCl。當(dāng)鹽離子濃度過高時(shí)，部分蛋白可能會(huì)因鹽析而出現(xiàn)沉淀， 此外過高的離子濃度會(huì)導(dǎo)致泳道內(nèi)局部電流過大，容易跑出笑臉狀條帶。實(shí)際過程中即使有少數(shù)蛋白可能需要高鹽提取的，也會(huì)借助透析等方法除去可能產(chǎn)生干擾的鹽分，最終NaCl濃度一般不能高于500mM。 3. 變性劑：常用的變性劑有兩類，一類是以尿素或硫脲為代表的變性劑，另一類則是各種表面活性劑（俗稱去垢劑）。變性劑的作用主要是為了使蛋白變性溶解，在膜蛋白和包涵體蛋白提取時(shí)經(jīng)常會(huì)加入尿素助溶。 4. 蛋白酶、去修飾酶抑制劑：組織或細(xì)胞內(nèi)通常含有大量的蛋白酶和去修飾酶，由于細(xì)胞在裂解過程中會(huì)釋放出多種內(nèi)源性的蛋白酶、磷酸酶、去乙?；傅龋菀讓?dǎo)致目標(biāo)蛋白降解或去修飾，從而影響后續(xù)的蛋白檢測(cè)。所以在裂解時(shí)還需加入一些酶抑制劑。 常見的蛋白酶抑制劑有：PMSF、Aprotinin、Leupeptin、 Pepstatin，AEBSF-HCl等，其中PMSF對(duì)多種不同活性中心的蛋白酶都有極好的抑制作用而且效率高，因此基本是必加的試劑。 另外，做磷酸化蛋白的Western blot時(shí)，還需要加入磷酸酶抑制劑，避免磷酸化形式的蛋白發(fā)生去磷酸化。類似地，檢測(cè)乙?；鞍椎臅r(shí)候還需要加入去乙酰化酶抑制劑。 碧云天生產(chǎn)多種多樣的蛋白樣品制備用酶抑制劑產(chǎn)品，以下是碧云天不同類型的蛋白酶、磷酸酶、去乙?；敢种苿┗旌衔?/strong>：
不同類型的蛋白酶、磷酸酶、去乙酰化酶抑制劑混合物 5. 還原劑：許多蛋白天然條件下存在二硫鍵而形成多個(gè)分子的聚合體，另有少數(shù)蛋白在制樣的過程中也會(huì)自發(fā)形成二硫鍵，在裂解液中引入還原劑可以有效地還原二硫鍵，常用的還原劑有B-巰基乙醇，DTT等。常見的上樣緩沖液中會(huì)含有DTT。 裂解液的選擇至關(guān)重要，碧云天生產(chǎn)適用于多種組織和細(xì)胞的裂解液，以下是碧云天裂解液相關(guān)產(chǎn)品與比較：   三 . 蛋白樣品制備操作 使用裂解液對(duì)細(xì)胞/組織進(jìn)行裂解，以釋放蛋白質(zhì)等細(xì)胞成分 3.1、細(xì)胞蛋白樣品制備 懸浮細(xì)胞：可直接離心收集，并用PBS等洗滌1-2次去除培養(yǎng)液中的血清和雜質(zhì)便可以裂解。 貼壁細(xì)胞：吸凈培養(yǎng)液后，直接加入裂解液裂解，或者在吸凈培養(yǎng)液后用PBS等洗滌1-2次后，加入裂解液裂解，收集細(xì)胞裂解液時(shí)可以根據(jù)具體情況使用細(xì)胞鏟和細(xì)胞刮進(jìn)行適當(dāng)?shù)妮o助。也可以在胰酶消化后參考懸浮細(xì)胞的方式裂解，但很多蛋白都可以被胰酶消化，并在WB檢測(cè)時(shí)可能會(huì)檢測(cè)到消化出來(lái)的短片段。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，也可用細(xì)胞刮或細(xì)胞鏟刮下或鏟下細(xì)胞，或用移液器吸取PBS將細(xì)胞從容器壁上吹打下來(lái)，再像懸浮細(xì)胞那樣洗滌后再裂解。 不管是懸浮細(xì)胞，還是貼壁細(xì)胞，裂解操作都是相同的：加完裂解液后，將細(xì)胞置于冰上，使其充分裂解。對(duì)于裂解不充分的細(xì)胞也可以再進(jìn)行冰浴超聲。裂解之后離心取上清進(jìn)行后續(xù)的蛋白濃度測(cè)定，加上樣緩沖液煮沸等操作。 貼壁細(xì)胞通常推薦吸除培養(yǎng)液后直接加入裂解液裂解，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞基本上是單層的，可以充分接觸裂解液，裂解更快快速和充分。 有一些研究人員喜歡使用1XSDS-PAGE上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞。這樣操作的優(yōu)勢(shì)是快速便捷，缺點(diǎn)是后續(xù)不方便測(cè)定蛋白濃度以校準(zhǔn)每個(gè)上樣孔的蛋白量。 3.2、組織蛋白樣品制備 組織蛋白提取則相對(duì)較復(fù)雜，首先應(yīng)設(shè)法除去血液、脂肪等非目標(biāo)組織。在制備脾臟、心臟和胎盤等富含血液的組織時(shí)，尤其要洗凈血液，防止后續(xù)因內(nèi)源IgG產(chǎn)生干擾。可用PBS或生理鹽水（加PMSF）洗滌2-3次去除組織中血液。也可以根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需要，在小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟用生理鹽水等灌流至肝臟和四肢顏色發(fā)白時(shí)，再采集特定的組織樣品。采集好的組織樣品可以立即進(jìn)行后續(xù)的處理，也可以在低溫冷凍保存待后續(xù)處理。 取好的組織樣品需要進(jìn)行破碎處理，否則難以裂解充分處理。實(shí)驗(yàn)室常用的破碎方法有勻漿法、研磨法等。最常見的比較便捷的方法是按照一定比例加入裂解液，用玻璃勻漿器或者適當(dāng)?shù)碾妱?dòng)勻漿設(shè)備進(jìn)行勻漿處理；最穩(wěn)妥可靠的方法是把組織樣品液氮冷凍后再研缽內(nèi)研磨成粉末，然后再加入裂解液裂解。組織樣品充分裂解后，離心取上清進(jìn)行后續(xù)操作。 勻漿法和液氮研磨法 四 . 操作過程中的注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng) 防止降解 前面已提到，一些組織和細(xì)胞內(nèi)經(jīng)常含有蛋白酶，在提取蛋白的過程中，有可能剪切目標(biāo)蛋白，所以我們可以從以下幾個(gè)方面來(lái)盡量避免蛋白被降解： 1、使用蛋白酶抑制劑抑制細(xì)胞或組織中釋放的蛋白酶活性。 2、低溫操作。提取蛋白時(shí)，避開蛋白酶的最適活性溫度。所有的步驟都可在低溫下完成，所有的試劑都需預(yù)冷，以降低蛋白酶活性，防止蛋白降解。 3、加快提取速度，一次不要處理過多的樣品 避免雜質(zhì)的干擾 電在蛋白提取中經(jīng)?？赡軙?huì)混入一些雜質(zhì)，后期影響電泳分離效果，常見雜質(zhì)有： 1、器材污染 在提取蛋白時(shí)盡可能使用潔凈器具，防止樣本被污染。尤其在處理組織樣本時(shí)，一些反復(fù)用的器具如勻漿器、研磨杵、研缽等需保持干凈。 2、核酸或脂類的干擾 核酸和脂類都可能與蛋白質(zhì)結(jié)合，如果制備的樣品中含有大量的脂類或核酸，則有可能影響目的蛋白泳動(dòng)速率，或者可能形成大的復(fù)合物而不能進(jìn)入濃縮膠。核酸通?？梢酝ㄟ^超聲處理或者使用1ml注射器(帶針頭)反復(fù)抽吸的方法打斷成小片段。在制備脂肪組織或者脂肪肝組織樣品時(shí)，在制樣后低溫離心或?qū)悠贩胖糜诘蜏兀蟛糠钟椭瑫?huì)漂浮在液面并很可能結(jié)凍，此時(shí)設(shè)法去除油脂或者吸取相應(yīng)的水相液體即可有效減小脂類的干擾。 五 . 蛋白提取完成后，可以用BCA法或Bradford法測(cè)定濃度，以確保上樣量穩(wěn)定可控，也可以通過SDS-PAGE后考馬斯亮藍(lán)法染膠或者在轉(zhuǎn)膜后通過麗春紅染色等判斷每個(gè)孔的上樣量是否一致，以及蛋白是否裂解充分、有無(wú)降解等。 為了保證每個(gè)泳道的上樣量一致，經(jīng)常需要將高濃度的樣品調(diào)低濃度或減少用量，或?qū)⒌蜐舛鹊臉颖緷饪s或加大用量。調(diào)低樣本濃度一般可直接用裂解液稀釋。濃縮樣本則建議進(jìn)行超濾操作，以保證操作前后離子濃度變化不大。 碧云天蛋白濃度測(cè)定相關(guān)產(chǎn)品
蛋白濃度分析測(cè)定相關(guān)產(chǎn)品 樣品制備的要點(diǎn)我們就介紹到這里 免疫印跡七步走，蛋白提取是重頭。 緩沖體系要得當(dāng)，中性略堿是主流。 離子濃度莫極端，鉀鹽切記謹(jǐn)慎投。 尿素硫脲有奇效，去垢劑需更深究。 防止降解頗重要，抑制劑要正確謀。 PMSF作用廣，EDTA性價(jià)優(yōu)。 切莫漏加還原劑，巰基分子破二硫。 RIPA buffer是首選，特殊提取細(xì)運(yùn)籌。 裂解細(xì)胞無(wú)他巧，勿借胰酶把懶偷。 組織裂解先除血，千方百計(jì)研磨透。 全程低溫要把握，快速操作記心頭。 避免雜質(zhì)生干擾，勿引蛋白核酸油。 提完濃度要測(cè)準(zhǔn)，跑膠染色見良莠。 常帶內(nèi)參顯嚴(yán)謹(jǐn)，結(jié)果明朗不發(fā)愁。 勤學(xué)苦練基本功，他日名聲傳五洲。 非常感謝您對(duì)碧云天的關(guān)注和支持， 碧云天愿與您攜手 為中國(guó)生命科學(xué)事業(yè)的騰飛貢獻(xiàn)一份力量! 電話：400-1683301，800-8283301 網(wǎng)站：www.beyotime.com |
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最后附上一個(gè)大神總結(jié)的
