謹(jǐn)以此文，紀(jì)念那些年我做過(guò)的Western blot。

                               —— 一位不愿透露姓名的科研民工

提起Western blot (WB)，很多人都能哭訴半宿。

這是一個(gè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，也是一個(gè)讓大家頭疼的實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)稱“玄學(xué)”。

話不多說(shuō)，做過(guò)的都懂。

今天給大家提供WB最全避雷手冊(cè)，希望大家能愉快實(shí)驗(yàn)，順順利利。

This    is    the    dividing    line.

傾 盡 全 力，長(zhǎng) 文 預(yù) 警

1、WB有什么優(yōu)點(diǎn)？

答： 靈敏，可達(dá)ng級(jí)，用ECL顯色法可達(dá)pg級(jí)。靈敏，相對(duì)便宜且特異性高。

2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒(méi)有目標(biāo)蛋白？

答：a) 你的細(xì)胞中并不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞或查文獻(xiàn)弄清楚；

       b)你的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；

       c) 你的抗體不能識(shí)別目的蛋白，檢查抗體說(shuō)明書，看是否有問(wèn)題。

3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？

答：a)有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻](méi)有變性完全，可以適當(dāng)提高SDS的濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng)，一般需96℃以上10-15min左右；

      b) 也不排除你的抗原濃度過(guò)高，這時(shí)需再加入適量上樣緩沖液。

4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小(10KD左右)，請(qǐng)問(wèn)怎么做WB？

答：盡量選擇0.2μm的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間；也可將兩張膜疊在一起再電轉(zhuǎn)。

5、我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？

答：最主要是加大抗原上樣量；同時(shí)也可以將一抗稀釋比例上調(diào)。

6、膠片背景很臟，有什么解決方法？

答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛龋淖円豢狗跤龝r(shí)間和溫度(盡量4℃過(guò)夜，此孵育條件比37℃1h要溫和很多)，并提高封閉液濃度。

7、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？

答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP催化活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q新進(jìn)口的顯色底物。

8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn)題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。

a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；

b) ECM底物中本身含雙氧水，不穩(wěn)定，見(jiàn)光或溫度高時(shí)易失活；現(xiàn)配現(xiàn)用。

c) ECL底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置；

d) 二抗時(shí)間過(guò)期，或平時(shí)使用不當(dāng)導(dǎo)致二抗失活。

9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來(lái)就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作，看是否有改善.；

b) 顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一般3-5分鐘就夠了，特殊情況需摸索顯色時(shí)間。

10、DAB好還是ECM好？

答：DAB有毒，但是比較靈敏，是HRP最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到檢測(cè)的閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè)pg級(jí)抗原。具體選擇還是要看你實(shí)驗(yàn)的情況，目前大家一般使用ECM。

11、抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大，是怎么回事？

答：a)所檢測(cè)的抗原形成二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)，可以打開(kāi)二聚體。

b)蛋白本身有修飾如糖基化、磷酸化等均會(huì)增大蛋白分子量。

12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí)Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么？

答：可能是：a)樣品濃度過(guò)低；b)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠。(注意！Marker并不是蛋白是否轉(zhuǎn)移到膜上的標(biāo)準(zhǔn)，它只是為我們提供簡(jiǎn)單的指示作用。)

13、磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？

答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。建議可多種抑制劑混合使用。

14、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無(wú)該蛋白的存在，需要做免疫組化和WB試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？

答：a)免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性，不易與背景區(qū)分；WB可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子，如抗體選擇合適，靈敏度很高。WB進(jìn)行定量，但是不能定位。

b)兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

15、做WB時(shí)，提取蛋白后凍存(未加蛋白酶抑制劑)，用了一抗，開(kāi)始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來(lái)越差，上樣量已加到120μg，換了一種一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？

答：懷疑是樣品問(wèn)題，可能是：

a)樣品不能反復(fù)凍融，建議制備好樣品后混勻，小體積分裝；

b)樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查WB過(guò)程，提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來(lái)說(shuō)，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑(PMSF在水溶液中不穩(wěn)定，30min就會(huì)降解一半，必須在每一分離和純化步驟中加入新鮮的PMSF，樣品處理超過(guò)1小時(shí)，補(bǔ)加1次。見(jiàn)水易分解，使用前加入)。

16、細(xì)胞水平要做WB，多少細(xì)胞提的蛋白夠做WB？

答：一般5×10^6就足夠了；特殊情況需根據(jù)自己的研究來(lái)確定。

17、同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么？這樣對(duì)WB有無(wú)影響？

答：能，完全沒(méi)有問(wèn)題；這是兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)。

18、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的WB檢測(cè)嗎？

答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品；有時(shí)如果抗體特異性高且效價(jià)高，同時(shí)使用2種一抗，可在一張膜上檢測(cè)2種不同蛋白。

19、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？

答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時(shí)最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性；部分膜蛋白不好提取，尤其是亞細(xì)胞器的膜蛋白。可考慮最新的invent柱式提取法，提取效率高，蛋白丟失較少。

20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？

答：你可以加大上樣量，沒(méi)有問(wèn)題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，加20％甲醇；還有一種辦法就是采用最新的WES來(lái)檢測(cè)，靈敏度極高，但價(jià)格貴。

21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作WB嗎？

答：200kd的蛋白不好做，分離膠用7％，積層膠 3.5％。這種分子量蛋白建議加大電泳電轉(zhuǎn)的電場(chǎng)強(qiáng)度和加長(zhǎng)作用時(shí)間，但必須控制溫度，保證低溫電泳和電轉(zhuǎn)。

22、如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增加上樣量？

答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問(wèn)題的，建議盡量不超載加樣。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，以增大上樣孔體積，可以試1.5mm厚的膠。

23、蛋白變性后可以存放多久？

答：-80℃，若沒(méi)有反復(fù)取出凍融，保存一兩年沒(méi)有問(wèn)題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。

24、我所測(cè)定的蛋白分子量是100KD左右，按理說(shuō)分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？

答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?05KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意目的條帶位置肯定會(huì)發(fā)生一定地偏移。

25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成，是嗎？

答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻^多的生物素，用BSA(5%、8%)代替會(huì)好一點(diǎn)。

26、一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？

答：WB一般上樣30-100μg不等，結(jié)果跟目的蛋白的表達(dá)豐度、上樣量、一二抗的量以及孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開(kāi)始摸條件時(shí)，為了拿到陽(yáng)性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來(lái)了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了。當(dāng)然有的蛋白不適合WB的怎樣做也不行，或者抗體效價(jià)低則注定事倍功半。

27、做組織樣品的WB的時(shí)候，怎樣處理樣品？

答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理(注意降溫)，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分(12000轉(zhuǎn)/min，10-15min)。膜蛋白必須用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。

28、大分子量蛋白200KD或以上，在做WB要注意什么呢？

答：做200KD蛋白的WB時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；膠很軟，剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)(至少300mA，3h或以上)；必須要使用大量程的Marker(否則出現(xiàn)雜帶不知如何分析問(wèn)題)。

29、有什么方法可以提高上樣量？

答：a)可以濃縮樣品；或增大上樣體積來(lái)增大上樣量；

b)用5X的上樣緩沖液來(lái)稀釋變性。

30、蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要求？

答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定，如果要求是定量和半定量的WB則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒(méi)有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了，但是不要超載。

31、一抗，二抗的比例是否重要？

答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉大部分的非特異性底色。

32、要做磷酸化某因子WB，其二抗有何要求？

答：主要是一抗要選擇好。對(duì)二抗無(wú)要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇，一般推薦用HRP標(biāo)記的二抗。

33、免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？

答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇(又稱抗原表位)，有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，蛋白煮后變性其構(gòu)象會(huì)消失，僅剩下一級(jí)結(jié)構(gòu)。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般我們做的時(shí)候沒(méi)有這么復(fù)雜的考慮，多看看抗體說(shuō)明書所注明的實(shí)驗(yàn)范圍來(lái)做，這樣省時(shí)省力。

34、WB中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？

答：所有的抗體工作溶液一般不主張回收凍存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2-3次。稀釋后應(yīng)在2-3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。

35、在做WB時(shí)，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。

36、檢測(cè)同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？

答：肯定可以，建議先檢查非磷酸化蛋白，然后使用抗體洗脫液將抗體洗去，再在該膜上重新孵育磷酸化一抗。

37、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？

答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移很慢，你延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡(轉(zhuǎn)過(guò)的表現(xiàn))。注意一點(diǎn)：麗春紅染色較好，不是你的目標(biāo)蛋白成功轉(zhuǎn)移至膜上的標(biāo)準(zhǔn)，這是兩個(gè)概念，；麗春紅染色很多時(shí)候只是提供一個(gè)粗略的參考而已。

38、做WB時(shí)，同樣的抗體在免疫組化能做出，而WB卻不能？

答：這多半是抗體的問(wèn)題，要看抗體的說(shuō)明，是否能做WesternBlot和免疫組化。

39、如果是6×8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？

答：一抗的稀釋度是有說(shuō)明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為3-5ml。建議盡量還是裁剪膜，不要整張膜孵育，費(fèi)抗體而且可能會(huì)孵育不均勻(個(gè)人建議，僅供參考)。

40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果。

答：無(wú)特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過(guò)一兩次的緩沖液；小編發(fā)現(xiàn)電泳時(shí)產(chǎn)熱也很厲害，其實(shí)可以在電泳時(shí)加冰浴。

41、跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？

答：沒(méi)有問(wèn)題，就是你膠里的水分被電泳產(chǎn)熱蒸發(fā)了。其次配好的膠在過(guò)夜時(shí)拿保鮮膜包起來(lái)，在里面加點(diǎn)電泳液保持濕度就可以了；也可能30%聚丙酰胺有問(wèn)題，你可以重新配制一份試試或直接買商用的30%聚丙酰胺；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用進(jìn)口試劑。

42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21KD和66KD可以一起轉(zhuǎn)，一起做。采用12％SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)120mA，45-60min就可以了，可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室?guī)熜謳熃愕恼{(diào)節(jié)；而170KD蛋白用7%SDS-PAGE，至少200mA 120min。

43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？

答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇(是指終濃度)，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜(0.2μm)。

44、我用的是可視Marker，但是電泳總跑不全8條帶，請(qǐng)問(wèn)什么原因？怎樣改善？膠用過(guò)8％，10％，12％，都是這樣。Marker是新買的。

答：一般來(lái)說(shuō)，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時(shí)間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇，現(xiàn)在已經(jīng)有商用梯度膠了，大家可自行選擇。

45、是否WB實(shí)驗(yàn)半定量一定要加內(nèi)參？

答：對(duì)于發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)一定要加內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)，證據(jù)充分。

46、核內(nèi)抗原WB內(nèi)參選擇什么合適？

答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，動(dòng)動(dòng)手查查就可以選出你要的內(nèi)參。(也可以私信小編哦)

47、做半定量WB，內(nèi)參β-actin，GAPDH哪個(gè)好？

答：一般選用β-actin就可以，也可以使用GAPDH，但是如果做能量、代謝這方面的研究還是盡量選擇β-actin。

48、想問(wèn)一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來(lái)源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？

答：一般來(lái)說(shuō)提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持冰浴，保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明必須使用特殊方法，一般來(lái)說(shuō)沒(méi)有區(qū)別。

49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBST的T是Tween嗎，濃度是多少？

答：T就是Tween，全稱Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST)，組成：8g NaCl，2.42g Tris base，加水800mL充分溶解, 加 500-1000μL 的 Tween-20，用HCl 調(diào)節(jié)pH 至 7.4，加水定容至 1L。

50、封閉，一抗，二抗時(shí)的溫度有沒(méi)有什么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在4度下?

答：均可在室溫進(jìn)行，如果時(shí)間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí)，然后4度過(guò)夜。小編建議盡量還是4℃過(guò)夜孵育，原因在上面已說(shuō)明。

51、請(qǐng)問(wèn)一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來(lái)，結(jié)果較差。PVDF膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白接合，同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。

52、怎樣才能跑出漂亮的膠，泳道都能很直，上樣的量和灌膠是否很重要，電壓有什么要求？

答：影響跑膠跑的質(zhì)量，提供2個(gè)小建議：

a)小電壓會(huì)使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠55V，分離膠75V就能跑得很好，但是實(shí)驗(yàn)的時(shí)間會(huì)很長(zhǎng)。

b)膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻(不要有氣泡)，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時(shí)，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠。

53、為什么提高大分子量蛋白的轉(zhuǎn)移的時(shí)候，小分子量蛋白會(huì)丟失一些哪?什么原因?

答：小分子的蛋白在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，會(huì)透過(guò)膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過(guò)去了。

54、電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象：

①“︶” 條帶呈笑臉狀

原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好；電泳系統(tǒng)溫度偏高，而且電場(chǎng)強(qiáng)度太大(電泳的電場(chǎng)大致呈現(xiàn)U形，所以因?yàn)橼s時(shí)間而加大電壓可能會(huì)出現(xiàn)這個(gè))。

②“︵” 條帶呈皺眉狀

原因：可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。

③條帶拖尾

原因：樣品溶解不好，或存在一定程度地蛋白降解。

④紋理(縱向條紋)

原因：樣品中含有不溶性顆粒，可能抽提蛋白時(shí)出了問(wèn)題。

⑤條帶偏斜

原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜，一定要子平面臺(tái)子上電泳，膠要做好。

⑥條帶兩邊擴(kuò)散

原因：加樣量過(guò)多，彌散至孔周圍了，減少上樣量或者使用5X上樣緩沖液。

55、WB結(jié)果中背景較高

可能的原因及建議：

①膜封閉不夠，建議延長(zhǎng)封閉的時(shí)間；選擇合適的封閉液。

②一抗稀釋度不適宜，太高，選擇最適宜的抗體稀釋度。

③ 一抗孵育的溫度偏高，建議4℃過(guò)夜孵育。

④選擇的膜容易產(chǎn)生高背景，一般NC膜的背景會(huì)比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一點(diǎn)。

⑤膜在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中干過(guò)或手套反復(fù)接觸過(guò)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意保持膜的濕潤(rùn)，使用鑷子夾取膜。

⑥檢測(cè)時(shí)曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可減少曝光時(shí)間。

56、WB結(jié)果中雜帶較多

可能的原因及建議：

①目的蛋白存在多個(gè)修飾位點(diǎn)(磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)等等)，本身可以出現(xiàn)多條帶。查文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，去除修蛋白飾后確定蛋白實(shí)際大小，這個(gè)需要一定的生物化學(xué)基礎(chǔ)和生信分析能力。

②目的蛋白有其它剪切本，查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析其可能性。

③樣本處理過(guò)程中目的蛋白發(fā)生降解，加入蛋白酶抑制劑；樣本處理在冰上操作。

④上樣量過(guò)高，過(guò)于敏感，適當(dāng)減少上樣量。

⑤一抗特異性不高，重新選擇或制備高特異性的抗體。

⑥一抗不純，純化抗體。

⑦一抗或者二抗?jié)舛绕撸m當(dāng)降低抗體濃度。

57、WB結(jié)果中無(wú)信號(hào)或顯示信號(hào)弱

可能的原因及建議：

①你所檢測(cè)的樣本中不表達(dá)目的蛋白，選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，用于確定檢測(cè)樣本是否為陰性，同時(shí)查閱文獻(xiàn)。

②檢測(cè)樣本低表達(dá)目的蛋白，提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。

③轉(zhuǎn)移不完全或過(guò)轉(zhuǎn)移，可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠(考馬斯亮藍(lán))后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過(guò)頭；適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流。

④抗體不能識(shí)別測(cè)試種屬的相關(guān)蛋白，購(gòu)買抗體前應(yīng)當(dāng)認(rèn)真閱讀抗體說(shuō)明書，確定其是否能夠交叉識(shí)別測(cè)試種屬的對(duì)應(yīng)蛋白。

⑤一抗孵育時(shí)間不足，建議4℃結(jié)合過(guò)夜。

⑥二抗與一抗不匹配，選擇針對(duì)一抗來(lái)源的種屬的抗體。

⑦洗膜過(guò)度，洗膜時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，加入的去垢劑不宜過(guò)強(qiáng)或過(guò)多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。

58、其它現(xiàn)象：

①膜上多處出現(xiàn)黑點(diǎn)或黑斑，原因有2點(diǎn)，抗體與封閉試劑發(fā)生非特異性的結(jié)合；或者配的奶粉沒(méi)有充分溶解，奶粉團(tuán)粘在膜上而沒(méi)洗干凈。

②反白(條帶顯白色)，原因一般是目的蛋白含量太高或者一抗?jié)舛绕摺?/span>

③蛋白分子量偏低或偏高，原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。

59、安全

愛(ài)護(hù)身體，保護(hù)自己。安全第一，實(shí)驗(yàn)第二。安全無(wú)小事！操作有毒試劑時(shí)，一要定帶手套和口罩，且操作揮發(fā)性試劑一定要在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。

This    is    the    dividing    line.

以上為本期內(nèi)容。簡(jiǎn)單地為大家提供一些建議，希望大家的實(shí)驗(yàn)?zāi)茼橅樌缛胀瓿蒘CI大業(yè)!