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做Western blot的小伙伴都清楚，我們提取蛋白要加各種蛋白酶或磷酸酶抑制劑，這些酶的作用和發(fā)揮作用最佳濃度你真的了解嗎？下面給大家一一盤點下。 DTT：二硫蘇糖醇，一種很強的還原劑，易被空氣氧化，穩(wěn)定性較差；但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命[1]。蛋白質(zhì)二硫鍵（又稱S?S鍵，由2個巰基-SH被氧化而形成）常作為活性中心發(fā)揮作用，是保持空間結(jié)構(gòu)的重要官能團。為了確定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，DTT可以將cys上的二硫鍵打開，使之成為線狀多肽鏈，這樣也便于抗體識別并結(jié)合特定的位點[2]。對于包埋于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的二硫鍵，DTT通常作用較弱，這類二硫鍵的還原需先將蛋白質(zhì)變性（高溫加熱或加入變性劑，如鹽酸胍、尿素或SDS）[3]。DTT在離子狀態(tài)下才有作用，pH7-9.5時作用最強，pH降至3以下可終止其作用。PCR反應(yīng)體系中加入DTT可以使蛋白質(zhì)從DNA上釋放出來，便于DNA和引物的結(jié)合，提高擴增效率。 使用濃度：DTT濃度太低起不到保護作用，濃度太高又會破壞結(jié)構(gòu)。建議在0.5mM~1.5mM之間。有的抗體說明書會給出目的蛋白的最佳使用濃度。 PMSF：苯甲基磺酰氟。是一種絲氨酸蛋白酶不可逆抑制劑。難溶于水，且在水溶液中非常不穩(wěn)定，容易分解，30min就會降解一半，因此提取蛋白時每一步都要加入新鮮的PMSF，樣品處理超過1h，補加一次。PMSF可溶于異丙醇、乙醇、甲醇、二甲苯和石油醚。有劇毒和腐蝕性。可抑制絲氨酸蛋白酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶），也可抑制半胱氨酸蛋白酶和乙酰膽堿酯酶[1]。室溫下可保存一年。 使用濃度：0.1~1mM NaF氟化鈉：溶于水（溶解度10°C 3.66、 20°C 4.06、30°C 4.22、 40°C 4.4、60°C 4.68、80°C 4.89、100°C5.08）、氫氟酸，微溶于醇，有毒[1]。酸性磷酸酶可逆抑制劑，可抑制絲氨酸、蘇氨酸磷酸酶，對堿性磷酸酶的效果較差，釩酸鈉才能有效抑制[4]。 使用濃度：10~20mM 焦磷酸鈉：溶于水，不溶于乙醇和其他有機溶劑。與Cu2+、Fe2+、Mn2+等金屬離子絡(luò)合能力強[1]。是絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶不可逆抑制劑。 使用濃度：1~2mM 正釩酸鈉：正釩酸鈉與釩酸鈉為同一物質(zhì)，化學(xué)式為Na3VO4 ，極易溶于水，溶液呈堿性，不溶于醇[1]。購買過來的一般是原釩酸鈉，需要經(jīng)過處理，使之變成單體才有效。磷酸酯酶抑制劑，可以抑制堿性、酸性磷酸酯酶，蛋白酪氨酸磷酸酯酶等磷酸酯酶，可逆抑制劑，也可以抑制Na+/K+ ATPase等ATPase。常用于抑制蛋白去磷酸化或促進蛋白的磷酸化激活，在提取細胞或組織蛋白時常用于保持蛋白的磷酸化狀態(tài)[5]。 使用濃度：1mM β-甘油磷酸(β-glycerophosphate)：是絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶可逆抑制劑。 使用濃度：1mM 通常在提取到蛋白之后，還需要經(jīng)過煮蛋白這一步，可能會有小伙伴奇怪了，為啥要“煮”蛋白呢？其實這是為了讓SDS和蛋白充分結(jié)合，是蛋白質(zhì)完全變性并解聚，形成棒狀結(jié)構(gòu)并帶上負電荷，從而可以在電場中移動；SDS還能斷開請柬，破壞二級和三級結(jié)構(gòu)，使得蛋白質(zhì)的電泳速度只跟分子量的大小有關(guān)。通常煮蛋白的條件是100℃，5min。但有一種特殊的需要用37℃孵育1h，或者60℃30min代替boiling5min，詳情可以戳這篇推文：“師兄，help! help! 我的蛋白為什么一直檢測不出來！”有的小伙伴也可能奇怪了，如果我煮蛋白時間過長過短會怎樣呢？時間過短就不必細說了，肯定是反應(yīng)不完全，如果一不小心煮蛋白時間過長，樣品會蒸發(fā)很多，如果蓋子崩開蒸發(fā)會更多，直接導(dǎo)致的一個后果是蛋白濃度定量不準確，其實筆者也挺好奇蛋白煮久了還有哪些其他后果。對于一些濃度大的蛋白樣品可適當延長煮蛋白時間。 另外，煮蛋白后還可能會出現(xiàn)結(jié)塊的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可能是由于蛋白樣品濃度過高，已經(jīng)超出了SDS可以結(jié)合的濃度，將樣品稀釋即可。 參考材料： 【1】百度百科 【2】https://wenku.baidu.com/view/b922554af7ec4afe04a1dfe8.html 【3】http://blog.sina.com.cn/s/blog_e4dda7bf0102x1jx.html 【4】丁香園 【5】https://china./trade/pdetail10865209.html 【6】Vigushin DM et al. Trichostatin A is a histone deacetylase inhibitorwith potent antitumor activity against breast cancer in vivo. Clin Cancer Res.2001 Apr;7(4):971-6. 【7】http://www./goods.php?id=16464 |
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