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原名：Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention.

譯名：微生物代謝因子可緩解小鼠彎曲桿菌病

期刊：Gastroenterology

IF：20.773

發(fā)表時間：2018.1

通信作者：Christian Jobin

通信作者單位：佛羅里達(dá)大學(xué)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖

1 清除微生物可促進(jìn)空腸彎曲桿菌所誘導(dǎo)的結(jié)腸炎

空腸彎曲桿菌在SPF小鼠體內(nèi)不能引發(fā)結(jié)腸炎（圖1A左，1B），但在無菌小鼠體內(nèi)卻能夠引發(fā)嚴(yán)重的結(jié)腸炎癥狀（圖1A右）。利用廣譜抗生素雞尾酒清除腸道微生物后，可使小鼠對空腸彎曲桿菌引發(fā)的結(jié)腸炎易感性增強(qiáng)（圖1A，中），但炎癥水平低于無菌小鼠。空腸彎曲桿菌感染能夠促進(jìn)小鼠炎癥因子Il1β、Cxcl2和Il17α的表達(dá)（圖1c）。 

圖1 清除小鼠的腸道微生物可促進(jìn)空腸彎曲桿菌所引發(fā)的腸道炎癥

2 微生物移植可改善空腸彎曲桿菌所引發(fā)的結(jié)腸炎

向無菌小鼠移植SPF小鼠的腸道微生物（CONV-Biota），可顯著改善空腸彎曲桿菌所引發(fā)的結(jié)腸炎（圖2A），降低炎癥水平（圖2B），但糞便中空腸彎曲桿菌的數(shù)量并未發(fā)生顯著變化。微生物移植后的小鼠炎癥因子Il1β、Cxcl2和Il17α的表達(dá)顯著下調(diào)（圖2D），結(jié)腸中髓過氧化物酶水平降低（圖2E），侵入結(jié)腸組織和腸系膜淋巴結(jié)的空腸彎曲桿菌數(shù)量下降（圖2F，G）。微生物移植后，結(jié)腸組織中mTOR下游靶蛋白p-p70S6K T389和p-S6(S235/236)的表達(dá)受到抑制（圖2H），進(jìn)而抑制了mTOR信號通路。因此，空腸彎曲桿菌可利用宿主的mTOR信號通路和炎癥反應(yīng)，入侵宿主的結(jié)腸組織，而微生物移植可通過阻斷mTOR信號通路及炎癥反應(yīng)，達(dá)到緩解結(jié)腸炎的目的。微生物移植前后，腸道中的空腸彎曲桿菌數(shù)量并無顯著變化。

圖2 微生物移植可緩解空腸彎曲桿菌所引起的腸道炎癥，且不依賴于空腸彎曲桿菌的定植作用

3 特異性厭氧微生物可減輕空腸彎曲桿菌引起的結(jié)腸炎

為了探討何種微生物對空腸彎曲桿菌所引起的結(jié)腸炎產(chǎn)生抗性，本文比較了無菌鼠轉(zhuǎn)移至SPF環(huán)境后第3天（未產(chǎn)生彎曲桿菌抗性）和第14天（產(chǎn)生抗性）的腸道微生物組成（圖3A）。二者在微生物多樣性和豐度上無顯著差異（圖3B，C）。而進(jìn)一步的分析表明，3天和14天的菌群，差異顯著的菌屬多為厭氧菌（圖3D）。 

圖3 厭氧菌在彎曲桿菌病抗性小鼠糞便中富集

為了驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，分別在有氧、微氧和厭氧條件下培養(yǎng)小鼠糞便中的微生物，再通過灌胃的方式移植給小鼠。結(jié)果表明，有氧和微氧條件下培養(yǎng)的菌群，均可加重空腸彎曲桿菌引起的結(jié)腸炎，而厭氧菌可顯著減輕結(jié)腸炎及炎癥水平（圖4A，B）。移植好氧菌與厭氧菌的小鼠，糞便中空腸彎曲桿菌的數(shù)量無顯著差異（圖4C）。此外，將3種條件下培養(yǎng)的菌群混合后移植給小鼠，也可對結(jié)腸炎起到保護(hù)作用。與之前結(jié)果相似，移植厭氧菌后，可顯著降低炎癥因子Il1β、Cxcl2和Il17α的表達(dá)（圖4D）。

根據(jù)上述結(jié)果，推測厭氧菌可對彎曲桿菌病起到保護(hù)作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，對移植了好氧菌、厭氧菌、以及分別在感染前和感染后移植厭氧菌的小鼠腸道微生物組成進(jìn)行了分析（圖4E）。與移植了好氧菌的小鼠腸道微生物相比，移植厭氧菌后，雙歧桿菌（Bifidobacterium）、梭菌XI（Clostridium XI）、Butyricicoccus、乳桿菌屬（Lactobacillus）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、產(chǎn)氫厭氧桿菌屬（Hydrogenoanaerobacterium）、糞芽孢菌屬（Coprobacillus）和顫桿菌（Oscillibacter）8種菌屬豐度增加，腸球菌（Enterococcus）和狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）豐度下降，空腸彎曲桿菌豐度無顯著差異（圖4F）。表明空腸彎曲桿菌的定植程度，并不是其引起結(jié)腸炎的主要機(jī)制。在上述11種菌屬中，有5種（圖4F種綠色字體部分）與抗炎反應(yīng)和膽汁酸及短鏈脂肪酸等代謝物的生成相關(guān)。梭菌XI、雙歧桿菌和乳桿菌都能夠?qū)⒛懼釓慕Y(jié)合態(tài)（如?；悄懰?/span>[TCA]）轉(zhuǎn)化成初級（如膽酸[CA]）和次級代謝產(chǎn)物（如脫氧膽酸[DCA]）。HPLC/GC分析發(fā)現(xiàn)，無菌鼠的膽汁酸主要以TCA形式存在，而移植了好氧菌及空腸彎曲桿菌感染鼠中，次級代謝產(chǎn)物DCA和熊脫氧膽酸（UDCA）被清除，初級代謝產(chǎn)物CA無變化（圖4G）。因此可以推測，次級膽汁酸代謝物在微生物介導(dǎo)的結(jié)腸炎保護(hù)作用中可能起著重要的作用。 

圖4 正常小鼠腸道微生物中分離出的厭氧菌可緩解空腸彎曲桿菌引起的結(jié)腸炎

4 微生物次級膽汁酸代謝產(chǎn)物DCA可保護(hù)和改善空腸彎曲桿菌引起的結(jié)腸炎

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，DCA能夠下調(diào)mTOR信號通路下游靶蛋白p-p70S6K（圖5A）。為了進(jìn)一步評估代謝產(chǎn)物對空腸彎曲桿菌病的作用，分別給予小鼠DCA、UDCA和石膽酸（LCA），同時，DCA又分為空腸彎曲桿菌感染前給藥和感染后給藥。結(jié)果表明，不論是感染前還是感染后飼喂小鼠DCA，均能有效的減輕結(jié)腸炎癥狀（圖5B，C），而感染前飼喂DCA的鼠糞便中，空腸彎曲桿菌數(shù)量與感染鼠無顯著差異。

圖5 菌群代謝產(chǎn)物DCA可抑制mTOR活性，預(yù)防空腸彎曲桿菌引起的結(jié)腸炎

UDCA和LCA對小鼠結(jié)腸炎無明顯的緩解作用（圖6A，B）。DCA除了能夠改善結(jié)腸炎外，還能夠顯著抑制結(jié)腸組織中Il1β、Cxcl2和Il17α的表達(dá)，而UDCA則促進(jìn)了上述炎癥因子的表達(dá)（圖6C）。

圖6 微生物代謝物LCA和UDCA對空腸彎曲桿菌引起的結(jié)腸炎作用極小

為了進(jìn)一步評估空腸彎曲桿菌病的保護(hù)機(jī)制，利用抗生素處理SPF小鼠，進(jìn)而驗(yàn)證代謝產(chǎn)物的作用。這里主要利用了2種不同的抗生素，分別為具有特異性清除厭氧菌作用的克林霉素和主要清除革蘭氏陰性菌的萘啶酸。結(jié)果表明，克林霉素處理可使小鼠對結(jié)腸炎的易感性增加，而萘啶酸處理后的小鼠對空腸彎曲桿菌引起的結(jié)腸炎仍有抗性（圖7A，B）。代謝產(chǎn)物分析表明，克林霉素能夠清除所有的次級膽汁酸，尤其是DCA，而萘啶酸僅降低CA含量，不影響DCA水平（圖7C）。

圖7 靶向消除次級膽汁酸生成菌可增加小鼠的空腸彎曲桿菌結(jié)腸炎易感性

空腸彎曲桿菌是一種非常常見的可引起細(xì)菌性腹瀉的食源致病菌。前期的微生物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，宿主對于空腸彎曲桿菌的抗性或易感性很難以參透。本文報(bào)道了常規(guī)的小鼠腸道菌群可緩解無菌小鼠體內(nèi)空腸彎曲桿菌所引起的腸道炎癥，且這種作用與病原菌在腸道內(nèi)的定植作用無關(guān)。分子和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，腸道微生物可抑制空腸彎曲桿菌引起的mTOR信號通路激活、炎癥因子表達(dá)、中性粒細(xì)胞浸潤以及空腸彎曲桿菌向結(jié)腸組織的轉(zhuǎn)移。微生物培養(yǎng)和移植實(shí)驗(yàn)表明，腸道微生物中的厭氧菌對空腸彎曲桿菌引起的結(jié)腸炎具有保護(hù)作用，其代謝產(chǎn)物DCA是宿主產(chǎn)生抵抗的重要原因。給無菌鼠直接補(bǔ)充DCA可預(yù)防和治療空腸彎曲桿菌引起的結(jié)腸炎，同樣，靶向清除次級膽汁酸生成菌后，可加重空腸彎曲桿菌病。這些研究均表明，腸道微生物的代謝產(chǎn)物DCA可通過抑制mTOR信號通路，對空腸彎曲桿菌病產(chǎn)生有益影響，但并不影響空腸彎曲桿菌的定植。

本文發(fā)現(xiàn)腸道微生物對空腸彎曲桿菌感染的保護(hù)作用，與該菌在腸道內(nèi)的定植無關(guān)。腸道微生物能夠阻止空腸彎曲桿菌向腸黏膜組織和腸系膜淋巴結(jié)入侵，但這一過程未伴隨著彎曲桿菌水平的降低。這一結(jié)果與艱難梭菌（C. difficile）、檸檬酸桿菌（Citrobacter rodentium）和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的感染機(jī)制不同。這些菌存在定植抵抗，腸道微生物可抑制這三種病原菌生長，降低其在腸腔內(nèi)的數(shù)量。

本文的研究成果對于腸道微生物如何控制宿主對病原菌的易感性，以及如何通過靶向微生物代謝物療法治療疾病均具有重要的意義。

作者通過環(huán)環(huán)相扣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，循序漸進(jìn)的向讀者展示了在空腸彎曲桿菌所引起的結(jié)腸炎中，腸道微生物是如何發(fā)揮自己獨(dú)特的保護(hù)作用的。文章的設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，思路清晰，非常值得本領(lǐng)域的科研人員仔細(xì)研讀。

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