【原】科研 | Gut ：自身免疫性肝炎中腸道菌群的改變(國人作品)

微生態(tài) 2021-04-13

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編譯：Jione、song，編輯：小菌菌、江舜堯。

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導(dǎo)讀

肝臟-微生物組軸的重要性已越來越多地被認(rèn)為是自身免疫的主要調(diào)節(jié)劑。這項研究利用一批初次使用糖皮質(zhì)激素治療的自身免疫性肝炎（AIH）患者與健康對照的腸道微生物進(jìn)行了對比研究。研究通過16S rRNA基因測序?qū)?/span>AIH（n = 91）和匹配的健康對照（n = 98）進(jìn)行了研究，分析了28名患者和34名對照以驗證結(jié)果。所有患者均在糖皮質(zhì)激素治療前被募集。

結(jié)果顯示與健康對照組相比：

① 初治類固醇患者的腸道微生物組具有較低的α多樣性（p<0.01）和獨特的總體微生物組成。

②專性厭氧菌的耗竭以及包括韋榮球菌在內(nèi)的潛在病原菌的擴(kuò)展與疾病狀況有關(guān)。重要的是，韋榮球菌是與疾病相關(guān)性最強(qiáng)的分類單元（p=8.85E-8），與血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平和肝臟炎癥呈正相關(guān)。

③此外，在研究隊列中，4個與AIH相關(guān)的屬可將AIH與對照組區(qū)分開，其AUC約為0.8。

④此外，在AIH腸道微生物組中，多個預(yù)測的功能模塊也發(fā)生了變化，包括脂多糖的生物合成以及氨基酸的代謝，這些氨基酸可以被細(xì)菌加工產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物。

本研究建立了AIH中腸道微生物組的組成和功能改變，并提出了使用腸道微生物群作為非侵入性生物標(biāo)記物評估疾病活動的潛力。

論文ID

原名：Alterations of gut microbiome in autoimmune hepatitis

譯名：自身免疫性肝炎中腸道微生物組的改變

期刊：Gut

IF：17.943

發(fā)表時間：2019.5.25

通訊作者：馬雄＆唐茹琦

作者單位：上海交通大學(xué)＆上海理工大學(xué)

實驗設(shè)計

本研究采集了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院門診的AIH患者以及相應(yīng)的健康者的糞便樣品，3h后置于-80℃保存樣品。對AIH患者進(jìn)行肝活檢，并根據(jù)scheuer系統(tǒng)評估炎癥和纖維化的嚴(yán)重程度。對樣品提取基因組后，通過16S rRNA基因測序?qū)?/span>AIH（n = 91）和匹配的健康對照（n = 98）進(jìn)行了橫斷面研究，分析了28名患者和34名對照的獨立組以驗證結(jié)果。所有患者均在糖皮質(zhì)激素治療前收集。

結(jié)果

1 類固醇治療的先天性AIH

科研人員研究了糞便微生物群，包括119名新診斷的AIH受試者以及132位年齡、性別和BMI匹配的健康對照者。根據(jù)受試者的注冊順序，將整個隊列分為發(fā)現(xiàn)小組（AIH：91；對照組：98）和驗證小組（AIH：28；對照組：34）。

2 AIH中α多樣性的降低和整體微生物組成的改變

在發(fā)現(xiàn)隊列中，AIH與個體內(nèi)多樣性的降低密切相關(guān)，通過香農(nóng)多樣性指數(shù)和觀察到的OTU數(shù)量得以衡量（圖1A）。校正年齡、性別和BMI后，結(jié)果得到證實。排除服用抗生素的患者后，相對于健康對照，AIH腸道微生物組的多樣性仍然明顯較低。在未使用UDCA治療的患者中也觀察到了這種趨勢，但僅觀察到的OTU數(shù)量達(dá)到了統(tǒng)計顯著性（圖1）。

為了評估微生物組成的總體多樣性，研究人員基于未加權(quán)的UniFrac距離進(jìn)行了主坐標(biāo)分析。變異的多變量多元分析表明，AIH和健康對照之間的腸道分類學(xué)組成存在顯著差異（圖1B）。兩組之間的微生物群落在加權(quán)UniFrac距離和Bray-Curtis不相似性上也存在顯著差異。

圖1 類固醇治療初治AIH患者(n=91)與健康對照組(n=98) alpha和beta多樣性的比較

3 與對照組相比AIH中細(xì)菌豐富不同

為了鑒定差異豐富的分類單元，本研究對91名AIH類固醇個體和98名健康對照組的糞便微生物群組成進(jìn)行了LEfSe分析。在AIH和健康對照中，擬桿菌和硬毛蟲是最主要的門。但是，兩組在門水平上均未觀察到顯著變化（圖2A）。在屬水平上，觀察到AIH和對照之間存在顯著差異（圖3）。兩組之間有15個細(xì)菌類群顯示出明顯的相對豐度。在調(diào)整了年齡、性別和BMI等協(xié)變量后，這些屬中的11個仍顯著不同（圖2B）。在AIH中觀察到細(xì)菌（包括梭菌，RF39，瘤胃菌科，理嚴(yán)菌科，顫螺菌，副細(xì)菌和共球菌）的豐度降低，而韋榮球菌，克雷伯菌，鏈球菌和乳桿菌的豐度增加。先前與PBC和原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）相關(guān)的韋榮球菌屬與疾病狀況之間具有最強(qiáng)的相關(guān)性（圖2C）。

為了進(jìn)一步驗證結(jié)果，進(jìn)行了多元分析，以控制年齡，性別，BMI，抗生素使用和UDCA治療的可能影響。最終確認(rèn)了11個屬中的7個，顯示AIH與對照之間存在差異（p <0.05）。同樣，韋榮球菌屬是與疾病狀況最顯著相關(guān)的屬（p = 0.0014）。

圖2 AIH中糞便菌群組成的變化

4 基于腸道菌群的特征識別疾病狀態(tài)

本研究使用腸道菌群作為生物標(biāo)記物的潛在價值，發(fā)現(xiàn)包括韋榮球菌，乳酸桿菌，顫螺菌和梭菌四個屬的組合可以將AIH與AUC（95％CI 0.71至0.84）的對照區(qū)分開（圖3A和C）。但是，使用所有11個屬并不能顯著改善預(yù)測性能。使用MaAsLin確認(rèn)的七個屬，得出的AUC為0.74。

然后，在28位未使用過類固醇的AIH和34位對照的獨立隊列中驗證了模型的分類能力。僅韋榮球菌屬產(chǎn)生的AUC為0.69（95％CI為0.55至0.83），以將AIH與對照區(qū)分開。使用上述四個屬將AUC增加到0.81（95％CI從0.70到0.92），類似于從所有11個與AIH相關(guān)的屬（AUC：0.78，95％CI 0.67到0.90）衍生的模型的性能作為由MaAsLin驗證的七個屬（AUC：0.81，95％CI 0.70至0.92）組成的模型（圖3B）。因此，韋榮球菌，乳酸桿菌，顫螺菌和梭狀芽孢桿菌的組合對AIH患者具有潛在的高診斷價值。

圖3 基于腸道微生物群特征的疾病分類

5 腸道微生物與AIH疾病活動之間的相關(guān)性

采用Spearman部分基于等級的相關(guān)檢驗，考慮年齡、性別、BMI、抗生素和UDCA的使用，以研究所有未接受類固醇的AIH的臨床變量與疾病相關(guān)屬之間的相關(guān)性（圖4A）。僅發(fā)現(xiàn)韋榮球菌屬的豐度與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）呈正相關(guān)（rho = 0.216，p = 0.022）。隨后進(jìn)一步檢查了韋榮球菌屬，發(fā)現(xiàn)該物種與AST表現(xiàn)出更明顯的相關(guān)性（rho = 0.266，p = 0.005）。然后根據(jù)中性弧菌的中位水平將AIH樣品二分為二：高水平弧菌（n = 60）的AIH患者的血清AST水平比低水平弧菌的患者AST的水平增加約兩倍（圖4B）。

在AIH患者中，肝臟組織學(xué)在確定診斷和評估疾病嚴(yán)重性方面起著關(guān)鍵作用。在本研究中，可獲得90例AIH患者的肝臟組織學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)而能夠探索腸道菌群與AIH的組織病理學(xué)程度之間的關(guān)系。27例患者有輕度/中度（0–2級）炎癥，63例是嚴(yán)重（3–4級）炎癥。輕度/中度（0-2期）纖維化36例，重度（3-4歲）纖維化54例。結(jié)果顯示，患者的α-多樣性或β-多樣性與炎癥等級或纖維化分期沒有顯著相關(guān)性（圖4和5）。此外，輕度/中度炎癥等級的患者與重度炎癥等級的患者之間只有維永氏菌的豐度顯著不同（p = 0.044，圖4C）。在晚期炎癥病例中，Dispar病毒含量更高（p = 0.013，圖4C），突出了其作為無創(chuàng)生物標(biāo)志物補(bǔ)充肝活檢的潛力。然而，這些發(fā)現(xiàn)不能承受控制協(xié)變量的線性回歸分析。

圖4 腸道微生物群與AIH疾病活動的關(guān)系

6 AIH中的微生物功能性失調(diào)

為了研究AIH和對照之間微生物群落的功能和代謝變化，基于16S rRNA數(shù)據(jù)推斷宏基因組，并使用PICRUSt分析了腸道菌群的功能潛力。LEfSe分析確定了32種KEGG類別，所有未使用類固醇的AIH（n = 119）和對照（n = 132）之間的豐度差異顯著（p<0.05）。用MaAsLin控制混雜因素后，仍然有17個功能模塊與疾病狀態(tài)顯著相關(guān)（p <0.05，圖5）。

研究人員還發(fā)現(xiàn)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的生物合成相對于對照組在AIH微生物組中似乎過度表達(dá)，這可能與AIH中觀察到的較高的TNF-α和IL6血清水平有關(guān)。此外，與多種氨基酸代謝有關(guān)的功能模塊已發(fā)生變化。在AIH微生物組中，包括細(xì)菌趨化性在內(nèi)的細(xì)胞運(yùn)動性顯著降低。

圖5 預(yù)測宏基因組的功能分析

討論

越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物組的改變與幾乎所有已知的肝病或免疫系統(tǒng)疾病有關(guān)。本研究中，通過16S rRNA基因描述了一個大型且新近診斷出的AIH人群的糞便微生物組的群落結(jié)構(gòu)。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，AIH微生物菌群失調(diào)的特征是細(xì)菌多樣性較低，并且11個細(xì)菌屬中的相對豐度發(fā)生了變化?；谖⑸锏奶卣鳎⒘司哂袇^(qū)分疾病狀態(tài)的能力的模型。最顯著的發(fā)現(xiàn)是在AIH患者中高度富集的韋榮球菌屬與疾病活動有關(guān)。

與健康對照組相比，AIH患者的糞便微生物組表現(xiàn)出降低的物種豐富度和均勻度。低細(xì)菌多樣性在各種疾病中屢有報道，被認(rèn)為是腸道營養(yǎng)不良的主要類型之一。在先前的研究中，PBC和對照之間的樣品內(nèi)多樣性差異不大，物種豐富度差異較小，PBC的均勻度降低。

AIH的腸道功能障礙是由韋榮球菌，鏈球菌，克雷伯菌和乳酸菌的相對豐度增加以及7種細(xì)菌的豐度降低所定義的。在AIH中擴(kuò)展的屬也被證明富含PBC和PSC中的糞便微生物群。在本研究中，韋榮球菌屬顯示出與AIH最顯著的關(guān)聯(lián)。韋榮球菌與高水平的AST和晚期肝炎相關(guān)。先前的研究表明韋榮球菌產(chǎn)生了LPS，這與本研究的發(fā)現(xiàn)一致：LPS的生物合成在AIH的腸道微生物組中更加豐富。先前的研究分析了AIH患者的口腔微生物群，還發(fā)現(xiàn)AIH中韋榮球菌的相對豐度增加，這與唾液中IL-1β、IL-8的含量呈正相關(guān)。據(jù)報道也與幾種嚴(yán)重的炎癥有關(guān)，包括反復(fù)發(fā)作的克羅恩病、骨髓炎和心內(nèi)膜炎。除相關(guān)證據(jù)外，鼠模型還顯示出腸道微生物在促進(jìn)腸道內(nèi)外的炎癥或擾動免疫穩(wěn)態(tài)的過程中起著重要作用。

AIH糞便中專性厭氧菌的減少和兼性厭氧菌（包括鏈球菌，克雷伯菌和乳桿菌）的擴(kuò)增，表明微生物群落向更具耐氧性的微生物轉(zhuǎn)移。許多厭氧性腸道菌群，例如瘤胃球菌科，協(xié)球菌和鏈球菌中的菌種，通過膳食纖維的發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFA）。SCFA通過消炎作用對健康產(chǎn)生有益作用。微生物群減少SCFA的產(chǎn)生會增加小鼠的腔內(nèi)氧氣濃度，從而導(dǎo)致兼性厭氧菌的擴(kuò)增。用兼性厭氧菌替代厭氧菌可能是不同疾病條件下的常見表現(xiàn)，包括慢性肝病。

組織學(xué)是準(zhǔn)確診斷AIH所必需的，并且在疾病管理中也很重要。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)用于評估AIH中的肝臟炎癥和纖維化的非侵入性生物標(biāo)記。在本研究中，由韋永氏菌、乳桿菌、鏈球菌和梭菌組成的模型能夠準(zhǔn)確區(qū)分AIH和健康對照，隨后進(jìn)行驗證。研究顯示，隨著疾病從輕度炎癥發(fā)展到嚴(yán)重炎癥。這些結(jié)果為無創(chuàng)性糞便測試有助于診斷和分層AIH個體的潛力提供了暗示性證據(jù)。除了明顯增加的“LPS生物合成”途徑外，推斷的AIH的基因組還以參與氨基酸生物合成和代謝的模塊功能障礙為特征。例如，在AIH的微生物組中色氨酸代謝發(fā)生了變化，色氨酸被腸細(xì)菌降解為幾種吲哚衍生物。吲哚是芳烴受體（AhR）的配體，它通過分泌IL22來促進(jìn)上皮屏障功能。此外，AIH微生物組中的精氨酸代謝耗竭，這可能導(dǎo)致其水平降低作為免疫調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物，多胺在腸粘膜和駐留免疫細(xì)胞的發(fā)育和維持中也起著重要作用。

先前的研究表明AIH與腸道通透性異常和腸道微生物組功能異常有關(guān)。這項研究在24個AIH和8個健康對照中比較了雙歧桿菌、乳桿菌、大腸桿菌和腸球菌的16s rDNA基因，發(fā)現(xiàn)AIH中雙歧桿菌和乳桿菌的表達(dá)不足。本研究結(jié)果存在差異，因為本研究中使用了更大的隊列，包括未接受類固醇治療的患者。最近的一項研究表明，在遺傳易感的鼠模型和包括AIH在內(nèi)的自身免疫性患者中，雞腸球菌可以轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟并觸發(fā)自身免疫應(yīng)答。在本研究中，糞便樣本中雞大腸桿菌的相對豐度非常低，并且AIH和對照之間沒有顯著差異。

本研究的主要優(yōu)勢包括在類固醇治療開始之前收集樣品，使用大量研究對象以及活檢證實的AIH的詳細(xì)表型分析。

①首先，利用16S rRNA基因測序而不是宏基因組測序是該研究的一個缺點，它限制了物種水平和功能分析方面的數(shù)據(jù)解釋。

②其次，本研究的發(fā)現(xiàn)可能受到諸如藥物、飲食攝入和環(huán)境因素等混雜因素的影響。盡管在分析中對抗生素和UDCA的使用進(jìn)行了調(diào)整，但藥物的混雜效應(yīng)可能尚未得到徹底評估，只是簡單地將抗生素或UDCA暴露的協(xié)變量視為二分法，而不考慮劑量效應(yīng)，這可能會扭曲它們對腸道微生物組成的影響。此外，在本研究中未考慮其他藥物，例如質(zhì)子泵抑制劑。

③第三，這是一項單中心研究，可能會限制基于微生物群的診斷模型的應(yīng)用。本研究提供了關(guān)聯(lián)而不是因果關(guān)系的證據(jù)，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究來評估與疾病相關(guān)的細(xì)菌，是否以及如何在AIH發(fā)病機(jī)理中的免疫功能障礙和肝臟炎癥中發(fā)揮作用。

本研究報告了對來自一個大型新診斷出的AIH人群的腸道微生物組的全面調(diào)查，并為疾病發(fā)病機(jī)理提供了新穎的見解，也增加了在AIH分層中使用非侵入性生物標(biāo)志物的可能性。

結(jié)論

肝臟-微生物組軸的重要性已被越來越多地認(rèn)為是自身免疫的主要調(diào)節(jié)劑。本研究通過16S rRNA基因測序?qū)?/span>AIH（n = 91）和匹配的健康對照（n = 98）進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：

①初治類固醇的腸道微生物組具有較低的α多樣性（p<0.01）和獨特的總體微生物組成。

②專性厭氧菌的耗竭和包括韋榮球菌在內(nèi)的潛在病原菌的擴(kuò)展與疾病狀況有關(guān)。

③此外，在AIH腸道微生物組中，多個預(yù)測的功能模塊也發(fā)生了變化，包括脂多糖的生物合成以及氨基酸的代謝，這些氨基酸可以被細(xì)菌加工產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物。

本研究建立了AIH中腸道微生物組的組成和功能改變，并提出了使用腸道微生物群作為非侵入性生物標(biāo)記物評估疾病活動的潛力。

評論

自身免疫性肝炎（AIH）是一種慢性的，免疫介導(dǎo)的肝病，其特征是肝細(xì)胞破壞，循環(huán)中自身抗體的存在和IgG血清水平的升高。本文分析了一個大型且特征明確的新診斷AIH人群中腸道微生物組的情況，在類固醇治療之前收集了樣本，包括有肝活檢的個體，因此含有組織學(xué)數(shù)據(jù)。本研究的發(fā)現(xiàn)有助于確定AIH的腸道營養(yǎng)不良以及與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。

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