Roche熒光定量試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)中文說明書

ypgao 2018-03-24

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注意：該使用指南為簡易版，在實際使用時請查閱正式英文說明書。
1. 產(chǎn)品概述
產(chǎn)品描述
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)為即用型、2×濃度的反應(yīng)混和液，該產(chǎn)品包含了基于SYBR Green I檢測模式的qPCR和兩步法qRT-PCR進(jìn)行實時DNA檢測時所需的所有試劑(除了引物與模板)。該試劑內(nèi)含參比染料ROX，適用于所有需要ROX校正的實時熒光定量PCR平臺。
儲存條件及其穩(wěn)定性
該產(chǎn)品在-15~-25°C條件下可穩(wěn)定存放至標(biāo)簽上的有效期之前。若存放于+2~+8°C條件下，則可短期儲存（不超過1個月）。
注意：請將該產(chǎn)品避光保存。
請避免將該產(chǎn)品反復(fù)凍融。
該反應(yīng)液添加引物與模板后可在+15~+25°C及避光條件下穩(wěn)定儲存24小時。
該產(chǎn)品用干冰運輸。
2. 產(chǎn)品使用方法
2.1 實驗前準(zhǔn)備
實驗最佳反應(yīng)條件(包括DNA模板和PCR引物濃度、孵育溫度和時間、循環(huán)次數(shù))應(yīng)根據(jù)特異性模板/引物而異。
樣本準(zhǔn)備
? 請使用純度、濃度經(jīng)優(yōu)化摸索且不含PCR抑制物的DNA模板(如，基因組學(xué)或質(zhì)粒DNA，cDNA)。為獲得高重復(fù)性的核酸分離產(chǎn)物，請使用以下試劑：
- MagNA Pure LC或MagNA Pure Compact系統(tǒng)結(jié)合系統(tǒng)配套的核酸分離試劑盒用于核酸自動分離。
- 手動分離請使用High Pure Nucleic Acid Isolation Kit。
更多詳細(xì)信息，請閱讀羅氏應(yīng)用科學(xué)部生化產(chǎn)品目錄，或訪問羅氏應(yīng)用科學(xué)部主頁 www.roche-applied-science.com.
? 請使用至多250 ng基因組DNA或50 ng cDNA。
請將DNA模板儲存于PCR級別的水中或5 – 10 mM 的Tris/HCl(pH 7.5-8.0)中。由于EDTA與鎂離子會形成敖合物，故請避免將模板溶解于TE緩沖液。
引物
PCR引物的最終濃度為0.1 – 0.4 μM。建議初次試驗時每種引物的濃度為0.3 μM。
注意：實驗中使用的引物對濃度相等。
PCR引物的設(shè)計決定了擴增子長度、熔解溫度、擴增效率及產(chǎn)量。引物設(shè)計同時也取決于PCR程序的選擇(兩步法與三步法)。
引物設(shè)計可通過實時PCR系統(tǒng)供應(yīng)商(如，PrimerExpress)提供的相關(guān)設(shè)計程序，或者您可以在網(wǎng)上獲取相應(yīng)的信息(如，Primer3: http://frodo.wi./)。
如果您想在后續(xù)實驗中用水解探針檢測您的實驗結(jié)果，請選擇熔解溫度(Tm)在+58~+60°C之間的引物。您也可以采用羅氏應(yīng)用科學(xué)部通用探針庫提供的預(yù)測試的探針來進(jìn)行驗證SYBR Green I檢測。與通用探針庫的探針相對應(yīng)的PCR引物的設(shè)計，請參考在線ProbeFinder 軟件 www.。
陰性對照
為了檢測DNA污染物，在陰性對照組中將DNA模板替換成PCR級別的水。
反應(yīng)體積
FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)適用于多種不同體積的反應(yīng)體系，反應(yīng)中使用的反應(yīng)管/板及合適的反應(yīng)液體積，請參考不同儀器供應(yīng)商的建議。
內(nèi)參染料ROX
原則上，實時PCR系統(tǒng)(除LightCycler系統(tǒng)外)提供了兩種不同的檢測方法：
? 結(jié)合內(nèi)參染料(通常為ROX)的檢測來校正各管SYBR Green I熒光信號。
? 單獨檢測SYBR Green I熒光信號。
檢測方法的選擇取決于所用儀器(如，是否具有檢測內(nèi)參染料熒光信號的通道)及儀器光源(鹵素?zé)艋蚣す?。
含ROX內(nèi)參染料的FastStart Universal SYBR Green Master被證實無需調(diào)整其ROX的濃度即可用于ABI儀器(ABI PRISM 7000 測序系統(tǒng)、ABI 7300 實時PCR 系統(tǒng)、ABI 7500 實時PCR 系統(tǒng)、ABI 7700 測序系統(tǒng)以及ABI PRISM 7900 HT 快速實時PCR系統(tǒng))，也可用于Stratagene Mx3000P QPCR 系統(tǒng)。
注意：如果您不使用實時PCR系統(tǒng)的參比通道或您的系統(tǒng)不配備參比通道，請選擇FastStart SYBR Green Master (without ROX)。
如果您使用Bio-Rad iCycler iQ5 實時PCR檢測系統(tǒng)，請選擇Universal SYBR Green Master (without ROX)，并參考Bio-Rad iCycler iQ5 實時PCR檢測系統(tǒng)指導(dǎo)手冊進(jìn)行External Well Factor Plate步驟以檢測孔道因子。
2.2 實驗步驟
PCR反應(yīng)液的準(zhǔn)備
以下操作為50 μl 反應(yīng)體系，如使用其他體系請作相應(yīng)修改。步驟操作
①
? 為了使試劑最大程度地保證實驗結(jié)果，在打開之前先將其融解，并于微型離心機上輕微離心。
? 用移液槍吹打混勻溶液后冰上保存。
注意：如果您使用的是5-ml或50-ml瓶裝的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)，請將小瓶上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次(請勿劇烈搖動)。
②
準(zhǔn)備100×濃度的PCR引物溶液(30 μM)。
③
將反應(yīng)管置于冰上，在50-μl的單個PCR反應(yīng)體系中，依次加入下表中的反
應(yīng)液組分；試劑體積最終濃度
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)
25.0 μl
1×
正向引物(30 μM)
0.5 μl
300 nM
反向引物(30 μM)
0.5 μl
300 nM
水，PCR等級
19.0 μl
總體積
45 μl
注意：如果需要準(zhǔn)備多次反應(yīng)PCR混合液，請將上述各組分體積按照z倍做準(zhǔn)備(z=反應(yīng)數(shù)+1)。
④
? 用移液槍將混合液小心混勻，請勿漩渦。
? 移取45 μl PCR混合液至PCR反應(yīng)管或PCR 微板孔中(取決于您的實時PCR系統(tǒng))。
⑤
? 加入5 μl DNA模板(不超過250 ng 基因組DNA或50 ng cDNA)。
注意：在初次試驗中為了獲得cDNA模板的最優(yōu)模板量，將未經(jīng)稀釋，1: 10稀釋，1: 100稀釋的cDNA模板進(jìn)行平行對照實驗。
? 用移液槍小心混勻。
⑥
? 根據(jù)儀器的指導(dǎo)手冊處理PCR管或PCR微板(如，使用透光的PCR管蓋或用自黏箔封閉PCR板)。
PCR
PCR擴增程序設(shè)計有很多種，兩步法與三步法都能產(chǎn)生比較理想的實驗結(jié)果。如采用兩步法，選擇長度較短的擴增子(約為150 bp)，且退火延長溫度應(yīng)為+60°C(如，典型的PCR反應(yīng)為95°C變形15s，60°C條件下退火并延長1分鐘，通常完成40個循環(huán))。
為了得到最佳結(jié)果，請確認(rèn)所使用的儀器已校準(zhǔn)過，并將實時PCR循環(huán)儀中檢測通道設(shè)置在SYBR Green 或 FAM(如，530nm)。
下表為標(biāo)準(zhǔn)PCR流程的例子：
注意：如果您使用配有FastPlate的ABI系統(tǒng)(如，ABI 7500 快速實時PCR系統(tǒng)或ABI PRISM 7900 HT 快速實時PCR 系統(tǒng))進(jìn)行20-μl反應(yīng)體系的快速qPCR流程，請根據(jù)括號中的提示進(jìn)行操作，循環(huán)時間可減至1小時。
①
請參考您的儀器供應(yīng)商提供的操作手冊，并根據(jù)以下參數(shù)進(jìn)行操作：循環(huán)數(shù) 分析模式目標(biāo)溫度持續(xù)時間備注
1(可選)
無
+50°C
2分鐘
如果反應(yīng)液中加入了UNG酶以防止交叉污染
1
無
+95°C
10分鐘
激活FastStart Taq DNA 聚合酶
4
無
+95°C
15秒(10秒*)
擴增與實時分析
定量
根據(jù)引物而定(典型為
60秒(30秒*)
+58~+60°C)
*為快速qPCR的持續(xù)時間。
②
將PCR管或PCR板放進(jìn)儀器開始反應(yīng)。
③
在反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器的定量與熔解曲線分析操作指南進(jìn)行結(jié)果分析。
2.3 相關(guān)步驟
防止交叉污染
UNG酶可防止 PCR 過程中的交叉污染。此技術(shù)過程包括在擴增中加入脫氧尿苷三磷酸鹽(dUTP)進(jìn)行產(chǎn)物擴增，在以后的擴增反應(yīng)中加入UNG并進(jìn)行高溫預(yù)處理。如果在后面的PCR反應(yīng)液中出現(xiàn)含有dUTP的前次擴增污染物，UNG會將污染物降解，從而失去被再擴增的能力而無法成為PCR模板。由于目標(biāo)DNA不含dUTP，因此不受UNG影響。
dUTP 是FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) 中的成分。
注意：防止交叉污染的步驟需要用到LightCycler Uracil-DNA Glycosylase。每50-μl PCR 反應(yīng)加入1.25 – 2.5 U。
兩步法RT-PCR
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)也可用于兩步法RT-PCR。在兩步法RT-PCR中，RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA是不在實時PCR儀器上進(jìn)行的獨立于其它反應(yīng)的步驟。利用cDNA 作為起始樣本材料來進(jìn)行后續(xù)的擴增及在線監(jiān)測需根據(jù)實時PCR標(biāo)準(zhǔn)流程操作。我們建議您使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，cDNA 合成的具體操作請參考相關(guān)說明書。
3. 相關(guān)產(chǎn)品訂貨信息產(chǎn)品名稱包裝目錄號
FastStart SYBR Green Master
4×1.25 ml
10×5 ml
04 673 484 001
04 673 492 001
FastStart Universal Probe Master(ROX)
2×1.25 ml
10×1.25 ml
10×5 ml
1×50 ml
04 913 949 001
04 913 957 001
04 914 058 001
04 914 066 001
FastStart TaqMan? Probe Master
2×1.25 ml
10×1.25 ml
10×5 ml
04 673 409 001
04 673 417 001
04 673 433 001
FastStart TaqMan? Probe Master (ROX)
2.5 ml(2×1.25 ml)
12.5 ml(10×1.25 ml)
50 ml(10×5 ml)
04 673 450 001
04 673 468 001
04 673 476 001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit
50 reactions, including 10 control reactions
100 reactions
200 reactions
04 379 012 001
04 896 866 001
04 897 030 001
LightCycler? Uracil-DNA Glycosylase
100 U
03 539 806 001
HighPure PCR Template
Kit for 100 purifications
11 796 828 001
Preparation Kit
Water， PCR-grade
25 ml(25 vials of 1 ml)
25 ml(1 vial of 25 ml)
100 ml(4 vials of 25ml)
03 315 932 001
03 315 959 001
03 315 943 001
詳細(xì)內(nèi)容請點擊下載：Roche熒光定量試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)中文說明書
英文版FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)

FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)
Universal ready-to-use hot start reaction mix for qPCR and qRT-PCR on all real-time PCR systems requiring normalization with ROX.
For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.

Product No.
Pack Size

04913850001

4 x 1.25 ml for up to 500 reactions of 20 μl final reaction volume

04913914001

10 x 5 ml for up to 5,000 reactions of 20 μl final reaction volume

FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) includes a novel reference dye that enables its use on all real-time PCR instruments requiring normalization with ROX, without modifications or adjustments to the specific instrument or protocol. This ready-to-use, 2x concentrated master mix contains all reagents (except primers and template) needed for running quantitative, real-time DNA detection assays, including qPCR and two-step qRT-PCR, in the SYBR Green I detection format. FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) generates excellent results on instruments such as the Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR System or the Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (see Figure 1). This product is not intended for use with LightCycler? Instruments.

Improve PCR sensitivity and specificity.
Minimize the formation of nonspecific amplification products.
Avoid over-estimation of qPCR results.
Eliminate nonspecific amplification products and primer-dimers that increase the amount of bound quantified SYBR Green I.
Amplify and detect a broad range of DNA or cDNA targets.
Amplify fragments up to 500 bp long, including those that are GC- or AT-rich.
Save time and effort in qPCR preparation.
Eliminate the need to mix components, titrate MgCl2, or perform other time-consuming optimization steps.
Prevent false positives resulting from carryover contamination.
Use this dUTP-containing mix with Uracil-DNA Glycosylase to eliminate contaminating DNA carried over from previous PCR reactions.

Contents
FastStart Universal SYBR Green Master (Rox), 2x concentrated master mix that contains FastStart Taq DNA Polymerase, Reaction Buffer, Nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), SYBR Green I, and a reference dye.

原文鏈接：http://www./archives/4878