CRISPR-Cas9 被譽(yù)為“基因魔剪”，但其編輯效率在不同場景下差異巨大。為何有些 Cas9 變體能高效編輯，而另一些卻頻頻“失手”？

近日，Molecular Cell 期刊發(fā)表了最新研究揭示了背后的核心機(jī)，這項(xiàng)由諾獎得主 Jennifer Doudna 教授（博士后史弘略為論文第一作者）領(lǐng)銜的研究，究揭示了廣泛 PAM 識別與基因組編輯效率之間的基本權(quán)衡，提出了高效的 RNA 引導(dǎo)的基因組編輯依賴于優(yōu)化的兩步靶標(biāo)捕獲過程，其中選擇性但低親和力的 PAM 結(jié)合優(yōu)先于快速的 DNA 解旋。這不僅解開了 CRISPR-Cas9 基因編輯效率密碼，還為設(shè)計更有效的 CRISPR-Cas 及相關(guān) RNA 引導(dǎo)的基因組編輯器奠定了基礎(chǔ)。

這些發(fā)現(xiàn)也為長期以來關(guān)于 CRISPR-Cas9 基因編輯“是否要犧牲效率換取廣譜性”的爭議畫上了句號。

Cas9 的“兩步走”策略

就像快遞員通過郵編和門牌號精準(zhǔn)投遞，Cas9 通過兩步精準(zhǔn)定位 DNA 靶點(diǎn)：

1、PAM識別：Cas9 首先識別目標(biāo) DNA 上的 PAM 序列（例如 NGG），鎖定目標(biāo)區(qū)域；

2、DNA解旋：隨后解開 DNA 雙螺旋，讓 gRNA 與靶序列配對，形成 R-loop 結(jié)構(gòu)并切割 DNA 雙鏈。

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：野生型 Cas9 與的 PAM 序列結(jié)合“快而松”——快速掃描大量非目標(biāo)位點(diǎn)后迅速釋放，一旦找到正確靶點(diǎn)則高效解旋。這種“點(diǎn)到即止”的策略，使其在復(fù)雜基因組中游刃有余。

寬松版 Cas9 的“效率陷阱”

為擴(kuò)大 Cas9 可靶向編輯的范圍，科學(xué)家開發(fā)了 Cas9 變體——SpRY，這種寬松版 Cas9（PAM-relaxed Cas9）可識別幾乎任何 PAM 序列，但這類工具卻存在嚴(yán)重缺陷：

• 陷入“溫柔陷阱”：SpRY 與非目標(biāo) DNA 結(jié)合更緊密，在錯誤位點(diǎn)反復(fù)停留，猶如陷入泥潭；

• 解旋速度減慢：即使找到正確靶點(diǎn)，其解旋效率僅為野生型 Cas9 的1/3；

• 敵我不分：競爭實(shí)驗(yàn)顯示，SpRY 在非目標(biāo) DNA 存在時效率暴跌 200 倍，而野生型幾乎不受影響。

研究團(tuán)隊(duì)通過單分子追蹤技術(shù)（AuRBT）首次捕捉到動態(tài)過程：SpRY 在靶點(diǎn)處反復(fù)嘗試解旋卻頻頻失敗，而野生型 Cas9 則“一氣呵成”。這種“卡殼”現(xiàn)象源于其過強(qiáng)的初始結(jié)合力，導(dǎo)致能量屏障升高。

設(shè)計新思路：平衡“搜索”與“剪切”

研究提出基因編輯器優(yōu)化法則：

1、弱化非特異性結(jié)合：避免工具酶被“無效位點(diǎn)”困?。?/span>

2、加速靶點(diǎn)解旋：通過設(shè)計突變，降低 DNA 解旋能量壁壘；

3、兩步協(xié)同優(yōu)化：在 PAM 識別與解旋速度間尋找最佳平衡點(diǎn)。

突破性驗(yàn)證：在靶點(diǎn)旁引入“DNA氣泡”（削弱雙螺旋穩(wěn)定性），SpRY 效率瞬間恢復(fù)至野生型 Cas9 水平，印證了能量壁壘理論。

未來展望

這項(xiàng)研究顛覆了“PAM 越寬松越好”的傳統(tǒng)認(rèn)知，揭示特異性與效率的精準(zhǔn)平衡才是關(guān)鍵?；诖?，科學(xué)家可重新設(shè)計 Cas9 變體：

• 開發(fā)“智能掃描”工具，在擴(kuò)展靶點(diǎn)范圍的同時保持高速搜索；

• 優(yōu)化古細(xì)菌來源的IscB/TnpB等新型編輯器，突破現(xiàn)有技術(shù)瓶頸；

• 助力遺傳病治療、作物改良等應(yīng)用，讓基因編輯更安全高效。

研究團(tuán)隊(duì)表示，這項(xiàng)研究提示我們，不應(yīng)該盲目追求去 PAM 化，未來基因編輯工具應(yīng)構(gòu)建一個多樣化的“PAM工具箱”，為不同臨床或科研需求選擇合適的 Cas9 變體，而非妄圖發(fā)出一個萬能工具。

論文鏈接：

https://www./molecular-cell/fulltext/S1097-2765(25)00301-6