背景Crispr/Cas9在微生物中起到的作用就是識別入侵、將病毒的DNA錄入自己的基因組，當病毒再次入侵時候，切割病毒DNA、RNA進而消除病毒的感染。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產(chǎn)生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細菌，利用細菌的細胞工具為自己的基因復制服務，細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR系統(tǒng)，利用這個細菌免疫系統(tǒng)，細菌地把病毒基因從自己的染色體上切除，這是細菌特有的免疫系統(tǒng)。 原理結(jié)構(gòu)Crispr在編輯基因的時候，需要2個成分①Cas9核酸酶；②gRNA（全稱是guide RNA，引導RNA）（需要設計里面的部分序列）。 Cas9其中Cas9核酸酶的基因已經(jīng)被整合到商業(yè)化載體中，因此使用者只要自行設計sgRNA，然后構(gòu)建Cas9/sgRNA表達載體，轉(zhuǎn)染細胞，就可以行使基因組的定點基因編輯任務。 sgRNA結(jié)構(gòu)gRNA（guided RNA）是CRISPR基因敲除敲入系統(tǒng)中重要的組成部分，由兩部分組成，分別是tracRNA和crRNA。其中crRNA引導cas9定位到要編輯的DNA序列附近，它有一段序列與tracrRNA的一部分是同源的，因此這兩者可以部分結(jié)合。 tracrRNA的作用在于：形成一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與Cas9蛋白結(jié)合，示意圖如下所示： 
將上圖的細節(jié)放大（圖片來源于Sigma），如下所示： 
如何發(fā)揮作用Cas9和gRNA會形成一個Cas9核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。這個RNP就能結(jié)合到基因組上的靶序列上。而基因組上的靶序列如果要被切割，需要滿足兩個條件： 第一，gRNA與基因組上有17-21個堿基的同源區(qū)，也被稱為protospace。 第二，靶序列附近有PAM（protospacer adjacent motif），需要注意的是，在設計gRNA時，PAM并不是gRNA的一部分，找公司合成的gRNA時，里面是沒有PAM序列的。 作用示意圖如下所示： 在tracrRNA引導下，gRNA與基因組上的靶序列結(jié)合，進而RNP切割靶序列，形成一個DSB。 下圖是Takara官網(wǎng)的原理示意圖： 
階段 1：外源 DNA 采集外源核苷酸是通過Cas 蛋白識別，入侵的短片段DNA（30-50個堿基對）被稱為protospacers，作為間隔序列插入宿 主CRISPR 位點中，由重復序列隔開。對于I型和II型系統(tǒng)來說，protospacers來自入侵 DNA 中兩側(cè)出現(xiàn)2-5 個核酸結(jié)構(gòu)（PAM，protospacer adjacent motif）的區(qū)域。一般 protospacers 連接在CRISPR 位點的一端，并且后者通過涉及 Cas1、Cas2 和 游離3’-hydroxyls 等元件的機制，牽引序列。Protospacer 的整合過程中也出現(xiàn)了牽引末端重新序列復制，這可能涉及宿主聚合酶和DNA修復機制。如下所示： 階段 2：crRNA 合成CRISPR RNA 在轉(zhuǎn)錄之后，生成初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：pre-crRNA，之后經(jīng)過加工，又成為一組短小的 CRISPR衍生RNAs（crRNAs），這些crRNAs 每一個都包含有對應于之前遇到的外源DNA的對應序列。 階段 3：靶向干擾在pre-crRNA轉(zhuǎn)錄的同時，與其重復序列互補的反式激活tracrRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也轉(zhuǎn)錄出來，并且激發(fā)Cas9和雙鏈RNA特異性RNase III核酸酶對pre-crRNA進行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9組成復合體，識別并結(jié)合于crRNA互補的序列，然后解開DNA雙鏈，形成R-loop，使crRNA與互補鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由Cas9中的HNH活性位點剪切crRNA的互補DNA鏈，RuvC活性位點剪切非互補鏈，最終引入DNA雙鏈斷裂(DSB)。CRISPR／Cas9的剪切位點位于crRNA互補序列下游鄰近的PAM區(qū)(Protospacer Adjacent Motif)的5’-GG-N18-NGG-3’特征區(qū)域中的NGG位點，而這種特征的序列在每128bp的隨機DNA序列中就重復出現(xiàn)一次。 補充：cas9解螺旋的過程Cas9可以解開DNA，gRNA和target dsDNA配對是在解旋之后所進行（文獻為：Sternberg, S. H., et al. (2014). “DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.” Nature 507(7490): 62-67.）。步驟如下：
下圖是Doudna那篇paper的原理解釋的figure 
sgRNA的序列特征和設計sgRNA的序列設計原理gRNA 設計靶序列選擇：在NCBI找到該基因CDS區(qū)，分析相應的基因組結(jié)構(gòu)，明確CDS的外顯子部分。按照基因本身的性質(zhì)，選擇候選的待敲除位點，確定待敲除位點。對于蛋白編碼基因，如果該蛋白具重要結(jié)構(gòu)功能域，可考慮將基因敲除位點設計在編碼該結(jié)構(gòu)域的外顯子。可選擇將待敲除位點放在起始密碼子ATG后的外顯子上。如果被敲除的靶標基因是microRNA或者lncRNA，可以將待敲除位點設計在編碼成熟microRNA的外顯子或在編碼成熟microRNA的外顯子的5’和3’側(cè)翼序列。 gRNA設計：通常情況下我們僅需要在你的目的位置附近找到PAM序列：NGG（N代表任意核苷酸），然后找到其緊鄰的上游20 nt即可 （如下圖所示）。 從前面的原理中可以知道，這個gDNA是與基因組上的正義鏈是相同的。 目的位置的選擇：我們絕大部分時候的目的是完全敲除一個基因，其原理是利用移碼突變（CRISPR/Cas系統(tǒng)誘導產(chǎn)生indel）。
因此我們一般選擇距離起始密碼子ATG下游200bp范圍內(nèi)的exon區(qū)域。另外，通常一個基因往往會轉(zhuǎn)錄成2個以上的轉(zhuǎn)錄本，所以請選擇盡量靠近5’端的公共部分，保證每個轉(zhuǎn)錄本都會成功移碼突變。 通常情況下，為了便于下游KO mutants的鑒定，我們往往可以作如下設計：即Cas9的切割位點剛好被一個酶切位點跨過，且附近至少100 bp內(nèi)酶切位點唯一（下游的敲除突變也能通過測序的手段來鑒定）。 上圖的酶切示意圖就顯示了，敲除突變無法被酶切，而野生型的則能夠進行酶切。 不過現(xiàn)在已經(jīng)有了很多在線的gRNA設計工具，現(xiàn)在就以其中的一個為例說明一下。 sgRNA的載體連接現(xiàn)在已經(jīng)有很多可以設計gRNA的工具，這里直接略過，直接看后文中所附的gRNA設計工具即可。 我們實驗室自己使用的是
因此，在合成gRNA的兩條鏈時，正義鏈上的oligo序列前面要加一個 例如我們最終確確定的gRNA序列為 那么最終需要合成的序列有2條：oligo1：5’-caccGCTGTTTGTGCAGGGCTCCGA -3’； oligo2：5’- aaacTCGGAGCCCTGCACAAACAGc-3’。加粗部分與經(jīng)BbsI酶切后的載體互補配對，BbsI的酶切位點如下所示： BbsI酶的信息如下所示： 全稱：BbsI-HF 貨號：R3539 保存條件：負20度 緩沖液：CutSmart Buffer（NEB帶有HF（即High Fidelity）字樣的酶都支持CutSmart） cas9基因編輯案例分析這個案例來源于Takara官網(wǎng)案例。 目標序列DNA的 這里需要注意幾點： 第一：尋找靶序列中的PAM序列，也就是NGG，我們需要注意的是，PAM序列并不是gRNA的一部分，因此在合成gRNA時，里面是沒有PAM序列的； 第二：RNP在切割靶序列時，是可以切割任意一條鏈的DNA的（可能是正義鏈，也可能是反義鏈，總之在做敲除時，最終目的就是破壞DFNA）。
上圖的流程是分三步：
文獻案例再來看一個文獻中的案例： 文獻信息如下所示：
文獻中是使用了cas9編輯了斑馬魚的etsrp基因，文獻中的示意圖如下所示：
紅色方框畫的就是靶序列，在Ensembl數(shù)據(jù)庫中檢索斑馬魚的etsrp外顯子2序列，如下所示：
導入Snapgene，標記出來gRNA序列，如下所示：
從上圖可以看到，這個gRNA序列就是位于正義鏈上。 實驗流程載體構(gòu)建流程1. Oligo退火形成duplex
PCR儀 95℃ 5 min，緩慢降溫至室溫1h，1：200稀釋duplex。 2. 質(zhì)粒酶切
加入以上成分，于37攝氏度酶切15分鐘（不同的酶有不同的酶切時間，這個要看說明書）。此處使用的Cas9載體的gRNA插入位點如下所示：
mark 3. 膠回收 大片段約11kb 回收，回收后的線性片段要放到負80度冰箱，因為 4. 連接
室溫連接4-6h，隨后轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時要把所有的連接體系加入到感受態(tài)中，因為載體的連接效率不高。 病毒包裝體系
如果是使用Lipo3000進行病毒包括，則整個包括體系如下所示：
注：注：（1）包裝質(zhì)粒PAX2 ：pMDG2：和目的基因質(zhì)粒=3:2:5，因此前期工作，每種質(zhì)粒的濃度最好為：[1]psPAX2（500ng/μL）[2]pMD2G（500ng/μL）[3]目的質(zhì)粒（500ng/μL） 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染條件與常規(guī)的病毒轉(zhuǎn)染相同。 轉(zhuǎn)染48h后，加入puromycin來篩選細胞，1mL的培養(yǎng)基，加5μL的嘌呤酶素（1mg/mL），也就是說嘌呤霉素的終濃度是5μg/mL。 測序加了嘌呤霉素的培養(yǎng)基要每天更換，每次里面都要含有5μg/mL的嘌呤霉素，這個時間要持續(xù)7天。在第7天的時候，取一定數(shù)量的細胞，提取DNA，測序，這一步的目的主要在于，確定是否存在有基因敲除的細胞，如果沒有，就要重新包病毒進行敲除。 如果存在基因敲除的細胞，那么gRNA切割位點處就會產(chǎn)生套峰，表示有效編輯的效應為50%，如下所示：
單克隆的獲取當測序結(jié)果出現(xiàn)套峰時，表明這批細胞中存在被敲除的細胞，此時就可以分離單克隆了，分離單克隆主要有下面的幾種方法。 有限稀釋法有有限稀釋法的過程為：收集細胞，計數(shù)，將細胞的密度稀釋為500個/mL，此時，用20μL移液槍吸取細胞懸液先點幾個孔 ,每孔約2μL，然后放在倒置顯微鏡下觀察 ,如每孔 1～2 個細胞，說明細胞濃度合適 ，則可一次點完 96 孔板，每個孔100uL。 這個過程也可以使用流式細胞儀分選，直接分到96孔板中，每孔種1個細胞。 直接挑單克隆
單克隆的鑒定 第一種方法，根據(jù)設計，推薦使用酶切鑒定的方法（見設計部分），通量高； 第二種方法，就是提取細胞DNA，跑膠，在gRNA序列的上下游設計一對引物，產(chǎn)物長度約500bp，敲除的細胞的條帶會縮減，由于gRNA只有20幾個bp，因此普通的瓊脂糖凝膠不容易看出差異，此時可以采用SDS凝膠，如果敲除的基因是非編碼的序列，那么就采用測序法； 第三種方法，測序，如果不熟悉SDS凝膠，可以采用普通的瓊脂糖凝膠，直接切膠，送測序； 第四種方法，如果有抗體，可以使用WB的方法。 gRNA設計網(wǎng)站收集
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來自： 永隆統(tǒng) > 《實驗技術(shù)》
