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勃起功能障礙（Erectile Dysfunction, ED）是指男性無法獲得或維持足夠完成性行為的勃起能力。全球有超過1.5億男性患有ED，預(yù)計(jì)到2025年患者數(shù)量可能超過3.2億。ED的常見病因包括衰老、糖尿病和心血管疾病。目前，磷酸二酯酶5抑制劑（PDE5Is）是治療ED的一線藥物，但約35%的患者對(duì)其無效。研究表明，DNA甲基化是一種通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）作用而不改變DNA序列的化學(xué)修飾，能夠調(diào)控基因表達(dá)。eNOS（內(nèi)皮型一氧化氮合酶）甲基化可抑制其表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。然而，目前尚不清楚低雄激素水平和1型糖尿病是否通過甲基化eNOS啟動(dòng)子區(qū)域來引發(fā)ED。

近日，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院王娜醫(yī)生為第一作者、姜睿教授為通訊作者，在《Andrology》（IF 4.5/Q2）雜志發(fā)表了題為《Methylation of eNOS in the rat penile corpus cavernosum under different pathological states and its relationship with erectile function》的科研成果。研究探討了1型糖尿病和低雄激素狀態(tài)對(duì)大鼠陰莖海綿體組織中eNOS基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的影響及其與勃起功能的關(guān)系。研究結(jié)果為基于不同病因的ED個(gè)體化治療方案提供理論依據(jù)。易基因科技為本研究提供所需的eNOS啟動(dòng)子DNA甲基化測(cè)序（Target-BS）技術(shù)服務(wù)。

本研究將58只8周齡雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為6組（每組6只）：假手術(shù)組、去勢(shì)組、去勢(shì)+睪酮（cast+T）組、正常血糖組、糖尿病組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-aza-dc，1.5 mg/kg）組。在假手術(shù)組、去勢(shì)組和去勢(shì)+睪酮替代組中，術(shù)后4周檢測(cè)最大海綿體壓力/平均動(dòng)脈壓（ICPmax/MAP）、血清睪酮（T）、一氧化氮（NO）濃度、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和eNOS的表達(dá)以及大鼠陰莖海綿體中eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。在正常血糖組、糖尿病組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組中，使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑6周后進(jìn)行上述檢測(cè)。

分析結(jié)果揭示了去勢(shì)組大鼠的ICPmax/MAP、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、eNOS和NO水平顯著低于假手術(shù)組和去勢(shì)+睪酮組。糖尿病組大鼠的ICPmax/MAP、eNOS和NO水平較低，而DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)水平顯著高于正常血糖組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組。去勢(shì)組大鼠陰莖海綿體中eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平與假手術(shù)組或睪酮替代組之間無顯著差異。糖尿病組大鼠陰莖海綿體中eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平顯著高于正常血糖組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組。

研究結(jié)果表明，盡管低雄激素狀態(tài)抑制了大鼠陰莖海綿體組織中甲基轉(zhuǎn)移酶的水平，但并未影響eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。高血糖通過上調(diào)陰莖海綿體組織中甲基轉(zhuǎn)移酶的水平和eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，抑制了陰莖海綿體組織中NO的水平和大鼠的勃起功能。甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以部分改善1型糖尿病大鼠的勃起功能。

研究方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：58只8周齡雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為6組（每組6只）：假手術(shù)組、去勢(shì)組、去勢(shì)+睪酮替代組、正常血糖組、糖尿病組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-aza-dc）組。

勃起功能檢測(cè)：通過測(cè)量最大海綿體壓力/平均動(dòng)脈壓（ICPmax/MAP）評(píng)估勃起功能。

組織學(xué)檢測(cè)：采用免疫組化和Western blot檢測(cè)DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和eNOS的表達(dá)。

NO濃度檢測(cè)：采用比色法測(cè)定海綿體組織中一氧化氮（NO）濃度。

DNA甲基化測(cè)序：采用靶基因DNA甲基化測(cè)序（Target-BS）技術(shù)檢測(cè)eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。

研究結(jié)果

（1）體重、ICPmax/MAP、血糖和血清睪酮

體重：糖尿病組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組大鼠體重顯著低于正常血糖組，而假手術(shù)組、去勢(shì)組和去勢(shì)+睪酮替代組之間無顯著差異。

ICPmax/MAP：去勢(shì)組大鼠在3V和5V電刺激下的ICPmax/MAP顯著低于假手術(shù)組和去勢(shì)+睪酮替代組。糖尿病組的ICPmax/MAP顯著低于正常血糖組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組。

血糖：糖尿病組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組血糖顯著高于正常血糖組。

血清睪酮：去勢(shì)組血清睪酮水平顯著低于假手術(shù)組和去勢(shì)+睪酮替代組，而糖尿病組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組與正常血糖組之間無顯著差異。

圖1：通過ICPmax/MAP評(píng)估每組大鼠的勃起功能。

（2）免疫組化

去勢(shì)組大鼠海綿體組織中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組和去勢(shì)+睪酮替代組。糖尿病組大鼠海綿體組織中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)水平顯著高于正常血糖組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組。

圖2：免疫組化檢測(cè)大鼠海綿體組織中 DNMT1 、 DNMT3a 和 DNMT3b 的表達(dá)水平。

（3）Western blotting

去勢(shì)組大鼠海綿體組織中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和eNOS的表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組和去勢(shì)+睪酮替代組。糖尿病組大鼠海綿體組織中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)水平顯著高于正常血糖組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組，而eNOS表達(dá)水平顯著降低。

圖3：Western blotting檢測(cè)DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和eNOS的表達(dá)水平。

（4）eNOS 中啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化測(cè)序

去勢(shì)組大鼠海綿體組織中eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平與假手術(shù)組和去勢(shì)+睪酮替代組之間無顯著差異。糖尿病組大鼠海綿體組織中eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平顯著高于正常血糖組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組。

圖4：通過靶基因DNA甲基化測(cè)序（Target-BS）檢測(cè)了eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。

1. 假手術(shù)組、去勢(shì)組和去勢(shì)+睪酮（cast+T）組eNOS啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平圖表；

2. 正常血糖組、糖尿病組和糖尿病+甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑組eNOS啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平圖表；

(C-D) eNOS啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的統(tǒng)計(jì)圖表。

易小結(jié)

本研究揭示了低雄激素狀態(tài)和1型糖尿病對(duì)大鼠陰莖海綿體組織中eNOS基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的不同影響。糖尿病通過上調(diào)甲基轉(zhuǎn)移酶水平和增加eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化，抑制eNOS表達(dá)和NO水平，進(jìn)而導(dǎo)致ED。甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑能夠部分改善糖尿病大鼠的勃起功能，但其效果有限。未來的研究應(yīng)進(jìn)一步探索2型糖尿病對(duì)eNOS甲基化的影響，并開發(fā)更具選擇性甲基化調(diào)控策略，以實(shí)現(xiàn)靶向ED的精準(zhǔn)治療。

Target-BS技術(shù)在本研究中的重要作用

Target-BS技術(shù)在本研究中用于檢測(cè)eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。該技術(shù)通過設(shè)計(jì)特異性引物、DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化、目標(biāo)基因甲基化擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物文庫(kù)構(gòu)建和文庫(kù)質(zhì)量控制測(cè)序等步驟，精確測(cè)量了eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。研究結(jié)果表明，糖尿病組大鼠海綿體組織中eNOS啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化水平與eNOS表達(dá)水平的顯著降低密切相關(guān)，而甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（5-aza-dc）能夠部分逆轉(zhuǎn)這種甲基化狀態(tài)，從而改善勃起功能。這一發(fā)現(xiàn)揭示了DNA甲基化在糖尿病引發(fā)的ED中的關(guān)鍵作用，并為開發(fā)靶向eNOS甲基化的治療策略提供重要依據(jù)。

易基因：DNA甲基化研究基本思路

DNA甲基化一般遵循四個(gè)步驟：

首先，進(jìn)行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關(guān)性分析等。

其次，進(jìn)行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結(jié)合分析、時(shí)序甲基化數(shù)據(jù)的分析策略、DMG的功能分析等。

再次，將甲基化組學(xué)&轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，包括Meta genes整體關(guān)聯(lián)、DMG-DEG對(duì)應(yīng)關(guān)聯(lián)、網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)等。

最后，對(duì)篩選出的目標(biāo)區(qū)域DNA甲基化進(jìn)行驗(yàn)證，通常采用靶基因重亞硫酸鹽測(cè)序（Target-BS）。

關(guān)于易基因靶基因DNA甲基化測(cè)序（Target-BS）

對(duì)目標(biāo)基因/CpG 位點(diǎn)甲基化檢測(cè)，建立靈活的靶向甲基化測(cè)序技術(shù)。易基因建立的靶基因甲基化高通量測(cè)序（Target Bisulfite sequencing，Target-BS）是針對(duì)已有目標(biāo)基因panel組合，運(yùn)用易基因自主研發(fā)的甲基化特異性多重PCR引物設(shè)計(jì)軟件，對(duì)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的目標(biāo)基因多重?cái)U(kuò)增，建庫(kù)后進(jìn)行超高深度（1000X以上）甲基化精準(zhǔn)檢測(cè)。

應(yīng)用方向：

Target-BS廣泛用于已知位點(diǎn)的甲基化Biomarker篩選、驗(yàn)證及臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用

• 后續(xù)目標(biāo)基因的甲基化驗(yàn)證

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 多基因多重?cái)U(kuò)增，檢測(cè)通量高；

• 超高深度亞硫酸鹽甲基化測(cè)序，相對(duì)于傳統(tǒng)BSP克隆測(cè)序，檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確性高，可準(zhǔn)確檢測(cè)到樣本中低于1%的甲基化水平；

• 樣本需求量低，20ng基因組DNA可實(shí)現(xiàn)多基因擴(kuò)增；

• 適用范圍廣，對(duì)基因組DNA、FFPE樣本、游離cfDNA等樣本均適用；

• 檢測(cè)費(fèi)用顯著低于現(xiàn)有技術(shù)、快周期、超高性價(jià)比。

易基因提供全面的表觀基因組學(xué)（DNA甲基化、DNA羥甲基化、cfDNA）和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA與蛋白互作）、DNA與蛋白互作及染色質(zhì)開放性技術(shù)方案（ChIP-seq、ATAC-seq），詳詢易基因：0755-28317900。

參考文獻(xiàn)：

Wang N, Jiang Q, Xie L, Cheng B, Liu QW, Jiang R. Methylation of eNOS in the rat penile corpus cavernosum under different pathological states and its relationship with erectile function. Andrology. 2023 May 24. doi: 10.1111/andr.13465.

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