看了我們上期的介紹，你應該已經了解在 Cre 工具鼠中 Cre 重組酶上游的啟動子決定了 Cre 在哪種組織或細胞類型中表達，這是基因敲除的空間特異性。那么條件性基因敲除的時間特異性又是怎么實現(xiàn)的呢？

今天我們就來說一說基因敲除的時間控制。

誘導型 Cre-loxP 系統(tǒng)介導了時間特異性基因敲除。通過對給予誘導劑的時間的控制，人為操控基因敲除的發(fā)生。

誘導型 Cre 有哪幾種類型？

啟動子激活型

通過誘導劑來調節(jié)驅動 Cre 重組酶的啟動子活性。

例如：四環(huán)素誘導型、干擾素誘導型

配體誘導型

通過將 Cre 重組酶與激素受體的配體結合域（ligand-binding domain，LBD）相融合，形成定位于胞漿的融合蛋白，只有在激素誘導后，融合的 Cre 蛋白才會通過構象變化從錨定蛋白 HSP90 上解離下來，進入細胞核，識別 loxP 位點并發(fā)生重組。

例如：雌激素誘導型

下面我們一一道來

1. 四環(huán)素誘導型 tetO-Cre

將四環(huán)素調控系統(tǒng)與 Cre-loxP 系統(tǒng)相結合，一般需要兩種轉基因小鼠交配使用：

· 一種是由四環(huán)素響應啟動子元件（TRE，也叫 tetO）控制的 Cre 工具鼠（TRE-Cre，也叫 tetO-Cre）。
· 另一種是由組織特異性啟動子驅動的表達四環(huán)素轉錄活化因子 rtTA 或 tTA 的小鼠。

tetO 本身缺乏啟動子活性，無法獨立驅動下游基因的表達。只有當具有轉錄激活功能的 rtTA 或者 tTA 與 tetO 結合后才能激活 Cre 的表達。  rtTA 或 tTA 與 tetO 的結合受四環(huán)素或四環(huán)素衍生物強力霉素（Dox）的調節(jié)。tTA 在沒有 Dox 的時候與 tetO 結合誘導 Cre 表達，有 Dox 的時候不能與 tetO 結合，Cre 不表達；rtTA 與 tTA 相反，有 Dox 的時候與 tetO 結合，誘導 Cre 表達, 沒有 Dox 的時候與 tetO 不結合，Cre 不表達。因此，在 tetO-Cre 與組織特異性 rtTA  （或 tTA ）雙轉基因陽性小鼠中，可以通過給予或撤離 Dox 來控制 Cre 重組酶在特定組織中產生的時間。

看起來有點復雜有木有？希望下面這張示意圖能幫你理解 tetO-Cre 在 CKO 中的應用。

tetO-Cre 與 rtTA 小鼠聯(lián)用，在給予 Dox 的情況下敲除目的基因。

圖片來自《Transgenesis Techniques Principles and Protocols》Third Edition

所以，利用四環(huán)素誘導條件性基因敲除需要 3 種基因工程小鼠同時使用，相互交配才能最終獲得 flox 純合且 Cre 與 rtTA（或 tTA）雙陽性的子代小鼠。整個系統(tǒng)較為復雜，繁育及基因型鑒定工作量都比較大。

2. 干擾素誘導型 Mx1-Cre

干擾素誘導是通過 Mx1 基因啟動子對于干擾素的響應來實現(xiàn)的。 Mx1-Cre 小鼠在一般狀態(tài)下不表達 Cre 重組酶，但可以通過干擾素 -α、干擾素 -β 或人工合成的雙鏈 RNA 類似物 poly I:C 的處理而誘導表達 Cre。

利用 Mx1-Cre 雖然可用于在發(fā)育過程中的任意時間點誘導目的基因敲除小鼠，但僅限于在響應干擾素的細胞中。目的基因敲除的效率也依賴于組織或細胞對干擾素的響應水平或干擾素響應細胞的數量。

Detection of the Extent of Cre-Mediated Recombination in Different Tissues of pIpC-Treated Arnt-Floxed/Mx1-Cre Mice.

圖片來自 Mol Endocrinol. 2000 Oct;14(10):1674-81.

3. 雌激素誘導型 Cre-ER

將雌激素受體（estrogen receptor，簡稱 ER）的配體結合區(qū)與 Cre 重組酶相融合，形成定位于胞漿中的融合蛋白（Cre-ER）。這樣就通過控制雌激素的注射時間，可以實現(xiàn)對基因重組時間特異性的調控。

可是機體自身不是就有雌激素分泌嗎？為了避免內源雌激素的干擾，在人 ER 的配體結合區(qū)做一個點突變（G521R）就可以使 Cre-ER 只響應外源的人工合成雌激素（比如：Tamoxifen、4-OHT） 的誘導，命名為  Cre-ERT。之后，另一種 LBD 突變體融合蛋白被證明對 4-OHT 具有遠高于 Cre-ERT 的敏感性，這種突變體就是大名鼎鼎的 Cre-ERT2 啦。它帶有人 ER LBD 中的 3 個點突變：C400V/M543A/L544A。

Cre-ER 系統(tǒng)，特別是 Cre-ERT2 ，是目前應用最廣泛的誘導型 Cre 系統(tǒng)。其較之四環(huán)素誘導型 Cre，系統(tǒng)更為簡單。我們只需要將 Cre-ERT2 設計在組織特異性啟動子之后，并與 flox 小鼠交配，就可以通過在特定時間點給予 Tamoxifen 來最終實現(xiàn)對靶基因的時空特異性敲除啦。

圖片來自《Transgenesis Techniques Principles and Protocols》Third Edition

文章來源南模生物，更多技術資料詳見：http://c.biomart.cn/modelorg/animal