1992年Gossen等成功地利用原核基因調(diào)控元件構(gòu)建了四環(huán)素(tetracycline,?Tet)真核細(xì)胞基因調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，利用Tet及其衍生物對目的基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。該系統(tǒng)是比較成熟的真核生物外源基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)之一，具有高效、精準(zhǔn)、安全、可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已被應(yīng)用于基因功能及基因治療的研究。

Tet誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)的作用原理

Tet誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)是以大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子上Tet操縱子原理來實(shí)施調(diào)控的。Tet阻遏蛋白(Tet?repressor?protein,?TetR)能與Tet操縱基因(Tet?operator,?TetO)特異性結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)無Tet時(shí)，TetR會與TetO結(jié)合，從而阻斷下游的抗性基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有Tet時(shí)，TetR的構(gòu)象發(fā)生改變，使TetR與TetO分離，從而引起抗性基因的抑制解除，抗性蛋白表達(dá)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。Tet調(diào)控系統(tǒng)目前根據(jù)其表達(dá)特點(diǎn)可以歸為兩大類：抑制型系統(tǒng)Tet-off和激活型系統(tǒng)Tet-on。

Tet-off系統(tǒng)

Gossen等最早建立了Tet-off基因調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由調(diào)節(jié)表達(dá)載體和反應(yīng)表達(dá)載體組成。調(diào)節(jié)表達(dá)載體包含一個(gè)由人巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子(PhCMV)啟動(dòng)的Tet轉(zhuǎn)錄活化因子(tetracycline?transcrip-tional?activator,?tTA)，tTA由TetR與單純皰疹病毒(HSV)VP16蛋白質(zhì)C端的一段轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合而成。反應(yīng)表達(dá)載體由Tet應(yīng)答元件(Tet-responsive?element,?TRE)、最小CMV啟動(dòng)子(minimal?CMV?promoter,?PminCMV)及目的基因組成。目的基因位于TRE和PminCMV的下游；TRE為7次重復(fù)的TetO序列。PminCMV缺失增強(qiáng)子，因此在tTA未結(jié)合到TRE時(shí)，目的基因不表達(dá)；相反，當(dāng)tTA結(jié)合到TRE時(shí)，VP16會使PminCMV活化從而使基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)無Tet或其衍生物強(qiáng)力霉素(doxcycline,?Dox)的存在時(shí)，tTA可與TRE結(jié)合，打開基因表達(dá)；而當(dāng)Tet或Dox存在時(shí)，它們可使tTA中的TetR改變構(gòu)象，則tTA將從TRE上脫落下來，使TRE中的PminCMV處于非激活狀態(tài)，從而使基因表達(dá)處于關(guān)閉狀態(tài)。

Tet-on系統(tǒng)

Tet-on調(diào)控系統(tǒng)與Tet-off調(diào)控系統(tǒng)的區(qū)別在于其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)為反義Tet轉(zhuǎn)錄活化因子(reverse?tetracy-cline?transcriptional?activator,?rtTA)。rtTA是由反義TetR(reverse?TetR,?rTetR)與VP16的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域融合而成。rTetR由TetR中的4個(gè)氨基酸發(fā)生突變而衍生而來的(E71→K71,?D95→N95,?L101→S101,?G102→D102)。rTetR的表型與TetR相反，在無Tet或Dox時(shí)，rtTA不能結(jié)合TRE，導(dǎo)致基因表達(dá)關(guān)閉；而在有Tet或Dox存在時(shí)，rtTA會結(jié)合在TRE上，導(dǎo)致基因表達(dá)開放。

Tet-on, Tet-off系統(tǒng)示意圖（Wanka F, et al., Fungal Genet Biol, 2016）

案例展示：

作者首先設(shè)計(jì)了一個(gè)具有強(qiáng)活性依賴性誘導(dǎo)譜啟動(dòng)子RAM，并將啟動(dòng)子RAM整合到Tet-off系統(tǒng)中構(gòu)建了RAM系統(tǒng)，RAM能驅(qū)動(dòng)Tet轉(zhuǎn)錄活化因子tTA的表達(dá)，導(dǎo)致tTA與Tet應(yīng)答元件TRE的結(jié)合，啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，Dox能阻止tTA與TRE的結(jié)合，在時(shí)間上對目的基因表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控。接下來作者以音調(diào)-恐懼條件反射(tone-fear conditioning,  TFC)行為范式將小鼠分為4組：對照組(HC)、TFC (Tone和Shock)組、Tone組和Shock組，將AAV-RAM-NLS-mKate2 和 AAV-Ef1a-EGFP 分別注射到小鼠杏仁核（聽覺傳入的主要輸入腦區(qū)）的LA、BA和CeA區(qū)，小鼠在注射病毒后至少1周服用Dox，TFC前48小時(shí)改為無Dox ，TFC后24小時(shí)處死。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，杏仁核LA、BA和CeA區(qū)在恐懼刺激后，RAM標(biāo)記的神經(jīng)元增多，神經(jīng)元活性增強(qiáng)，表明杏仁核LA、BA和CeA區(qū)參與小鼠恐懼記憶的形成。

RAM系統(tǒng)標(biāo)記杏仁核中活躍的神經(jīng)元群（S?rensen AT, et al., Elife, 2016 ）

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參考文獻(xiàn)：

1. 陳皓,?夏海濱. 四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)的研究與應(yīng)用. 生命的化學(xué). 2011; 31(2): 285-89.

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