前言

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種危及生命且高度異質性的疾病，發(fā)病率在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第二位，目前仍無法治愈。臨床上常通過多參數流式細胞術（multiparameter flow cytometry，MFC）可識別漿細胞異?？乖磉_并精確判斷其克隆性，常用于多發(fā)性骨髓瘤（MM）微小殘留?。∕RD）的檢測，以評價治療的有效性并預測預后。近年來，盡管在化療、蛋白酶體抑制劑、免疫調節(jié)劑利沙度胺衍生物、CD38靶向抗體方面取得了很大進展，但幾乎所有患者終將復發(fā)，其根源是存在MRD，因此檢測MRD對于判斷療效、指導治療及預測預后有著重要意義。

MRD檢測一般流程

目前國內MM-MRD常用8-10色抗體組合行胞膜和胞質抗原檢測，歐洲流式學會建議應用2管8色抗體組合的二代流式細胞術（Next generation flow cytometry，NGF），但在我國還不能普遍應用。我們在日常工作中發(fā)現，初診MM患者高表達CD38和CD138，異常表達CD45、CD19、CD20、CD56、CD81和CD117等胞膜抗原，限制性表達胞質輕鏈cKappa（cκ）或cLambda（cλ）。

下面介紹通過流式細胞術檢測MM MRD一般流程

（1）樣本采集

        骨髓（BM，優(yōu)選）或外周血（PB）

        EDTA（優(yōu)選）或肝素鈉抗凝，3-5ml

        運輸存儲條件：4-8℃，48h之內檢測。

（2）樣本制備

        先裂紅再染色，或先染色再裂解，都是可以的。如果樣本細胞密度低，為了收集到足夠的細胞數量，建議用前一種方法，但裂解液需注意，要用無固定劑的氯化銨裂解液。對于胞質抗體需要事先用1×PBS至少洗滌三次，破膜處理后再加入胞質抗體。密度梯度離心不建議，這樣容易導致漿細胞丟失，ficoll會加速漿細胞表面CD38和CD138的丟失。

（3）設門分析

        建立CD38/Time參數圖，選擇液流穩(wěn)定區(qū)域，接著利用FSC-A/FSC-H去除非特異和黏連體，最后通過CD38/CD138和/或CD38/CD45進行設門，圈出漿細胞，通過其他抗原即可進一步圈出正常漿細胞和異常漿細胞群體，最終通過cKappa/cLambda比值確定漿細胞的克隆性。

（4）MRD結果判斷

        絕大多數正常漿細胞表型為CD38++CD138+CD45+CD19+（>75%）CD27+CD56-CD81+CD117-，非限制性表達輕鏈cKappa或cLambda（cyk或cyλ）；異常漿細胞免疫表型會出現CD45、CD19、CD27、CD38、CD81的異常低表達或不表達，以及CD56、CD117的異常表達，且限制性表達輕鏈cKappa或cLambda（cyk或cyλ）。

正常漿細胞和異常漿細胞相關抗原表達

案例展示

病例一，流式二維散點圖如下

這是一個通過CD38單抗治療后的病例，通過流式二維散點圖分析發(fā)現該病例的MRD結果陽性，異常細胞（圖示紅色）免疫表型為CD45-CD38-CD138+CD19-CD56-CD27part，輕鏈cLambda呈限制性表達。通過CD38單抗的靶點治療，MRD仍然陽性，但此時的CD38靶點已經消失，后續(xù)監(jiān)測不能用CD38作為設門抗體。

病例二，流式二維散點圖如下

通過流式二維散點圖分析發(fā)現該病例MRD結果陽性，異常細胞（圖示紅色）免疫表型為CD45-CD38-CD138+CD56+CD27-BCMApart，輕鏈cKappa呈限制性表達，同樣將CD38作為靶點治療，治療一段時間后，該靶點消失，MRD仍然陽性，后續(xù)監(jiān)測不能用CD38作為設門抗體。

病例三，MM初診病例，流式二維散點圖如下

根據流式二維散點圖分析，異常細胞（圖示紅色）初診免疫表型為CD45-CD38++CD19-CD56++CD27-BCMA+（dim），輕鏈cKappa呈限制性表達，后續(xù)治療后可以通過上述表型進行MRD監(jiān)測。

病例四，表型異常的多克隆漿細胞，流式二維散點圖如下

紅色細胞群免疫表型CD45-CD19-CD38++CD138+CD27+CD56+，輕鏈cKappa、cLambda呈多克隆表達。

治療進展

CAR-T技術在目前備受關注，CAR-T治療已經在血液惡性腫瘤治療中取得了長期的臨床療效和成功的商業(yè)轉化。當前最熱門的靶點仍然是CD19，但在漿細胞腫瘤上CD19的表達比較少，因此將BCMA作為聯合治療的靶點發(fā)揮出了它的潛力。B細胞成熟抗原BCMA（又叫CD269，也叫TNFRSF17，TNF配體超家族成員）是腫瘤壞死因子受體超家庭的成員，主要在漿細胞和成熟B細胞中表達，在多發(fā)性骨髓瘤（MM）的增殖、存活和腫瘤進展中起著至關重要的作用。目前處在臨床前和臨床階段的靶向BCMA的MM療法主要包括抗體藥物偶聯物、雙特異性抗體和嵌合抗原受體T細胞免疫療法。

BCMA-targeted immunotherapies

結語

隨著靶向治療的日趨發(fā)展，在MM的免疫分型和MRD檢測中，對于作為靶點的標記，在方案設計中應將該靶點抗體加入對于臨床評估、診斷、治療十分有必要，同時需要注意例如CD38作為靶點，會導致某些復發(fā)的病人CD38轉陰，所以在設門的時候需要格外關注，必要的時候采用一些其他抗原進行輔助設門可以更準確的進行監(jiān)測。

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