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首先給大家介紹一下，各種類型B細胞細胞標志物的表達情況，見下圖1，這有助于我們后期對B細胞進行分型。 圖1 生發(fā)中心B細胞（GCB）、記憶B細胞以及抗體分泌型B細胞的表面標志物[1] 接著給大家介紹一下CD40/CD40L系統。CD40/CD40L系統最早由Banchereau等人于1991年提出，目前已成為B細胞體外擴增和培養(yǎng)最常用的系統。其中，CD40屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族的一員，廣泛表達于免疫細胞表面，包括B細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，同時也表達于上皮細胞、內皮細胞、血小板等非免疫細胞表面。CD40的配體CD40L也屬于TNF家族，主要表達于活化的T細胞表面，尤其是活化的CD4+T細胞，此外在活化的γδT細胞，NK細胞，血小板等的表面也有表達。CD40/CD40L系統對B細胞的生長發(fā)育具有重要作用。有研究報道，它可以促進B細胞的存活和增殖，促進B細胞的分化，誘導B細胞免疫球蛋白類別的轉換，抑制B細胞的凋亡。接下來我們就來介紹利用CD40/CD40L系統對人B細胞進行體外擴增培養(yǎng)的方法。一、CD40/CD40L系統用于B細胞體外擴增與培養(yǎng)實驗步驟如下[2]： （1）6孔細胞培養(yǎng)板或者10 cm細胞培養(yǎng)皿預先過夜接種表達CD154（CD40LLOW細胞系）的基質細胞，作為B細胞培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細胞。（2）將B細胞接種至6孔板（2 mL/孔）或者10 cm培養(yǎng)皿（6 mL /皿）的飼養(yǎng)層細胞上，調整B細胞密度為100/cm2。（3）培養(yǎng)條件：R5培養(yǎng)基（含有5%人血清、55 μM 2-巰基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉和1%MEM非必需氨基酸），并補充重組人IL-2（50 ng/mL）、IL-4（10 ng/mL）、IL-21（10 ng/mL），和BAFF（10 ng/mL），連續(xù)培養(yǎng)B細胞8天，培養(yǎng)時間根據實驗目的可進行改變。（4）在第4天和第6天，棄去一半舊培養(yǎng)基（避免觸碰底部細胞），并用預熱的、含細胞因子的新鮮R5培養(yǎng)基等量替換。當培養(yǎng)時間超過8天時，須在第8天將B細胞轉移至新的飼養(yǎng)層細胞上，同樣在轉移后的第4、6天等量替換培養(yǎng)基。（5）細胞培養(yǎng)結束后，收集B細胞進行計數，并在液氮中冷凍保存待用。（6）此外，作者根據初始B細胞增殖動力學的結果，優(yōu)化了B細胞的接種密度與B細胞培養(yǎng)時間的聯系。第0天首次接種的B細胞數分別為1×104、2.5×103和1×103/孔時，可用于B細胞進行為期4、6和8天的培養(yǎng)；8天后，將B細胞加至新的飼養(yǎng)層細胞，此時控制B細胞數分別為4×104、1×104、2.5×103和1×103/孔，可用于B細胞為期10、12、14和16天的培養(yǎng)。注：在該細胞培養(yǎng)體系中，細胞因子以及CD40（B細胞）-CD154（飼養(yǎng)層細胞）的相互作用可以促進初始/記憶B細胞增殖、活化以及APC功能的獲得。其中，IL-21可促進B細胞的大量增殖；B細胞激活因子BAFF是TNF家族成員，促進B細胞的存活和成熟，并可促進記憶B細胞向漿細胞分化。IL-4和IL-21則對不同Ig亞型具有調節(jié)作用，可根據實驗目的選擇性添加。
圖1 B細胞體外培養(yǎng)細胞形態(tài)學圖2 B細胞體外培養(yǎng)細胞分化情況 初始B細胞經該方法進行體外分離培養(yǎng)后，獲得激活表型，能夠有效促進抗原呈遞，并最終可以分化為分泌抗體的漿母細胞和漿細胞。具體表現為：B細胞表面MHC-Ⅱ分子，共刺激分子CD80和CD86表達增加；B細胞表面抗體經歷IgM→IgG的轉化；記憶B細胞相關的分化標志物CD27表達增加；以及B細胞抗體分泌相關標志物CD138表達增加。 
評價：該方法不僅可用于初始B細胞的分離與體外擴增培養(yǎng)，還能有效促進B細胞增殖和分化，增強B細胞向T細胞呈遞抗原促進T細胞激活的功能。二、接著，給大家介紹另一篇關于體外GCB細胞培養(yǎng)的系統，大致過程與方案一類似。實驗步驟如下[3]：（1）40LB細胞的處理與輻照（以下為10 cm細胞培養(yǎng)皿的操作步驟）：10 mL 3T3培養(yǎng)基培養(yǎng)40LB細胞，每隔三天傳一次代，可以體外持續(xù)培養(yǎng)1個月以上。 注：40LB細胞是一種穩(wěn)定表達CD40L和BAFF的BALB/C 3T3細胞。3T3培養(yǎng)基：高糖型DMEM，補充10% FBS，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。① 40LB細胞從液氮中解凍孵化成功后，以5×106接種至細胞培養(yǎng)皿，大約2天可以長滿； ② 棄去培養(yǎng)液，2 mL PBS洗滌細胞后，以胰酶-EDTA溶液消化細胞，室溫條件下290 g離心5 min。 ③ 棄上清，加3T3培養(yǎng)基重懸細胞，按下表接種至合適細胞培養(yǎng)板中，讓細胞充分貼壁生長。④ 以80 Gy的γ射線照射，抑制40LB細胞的增殖，用作后續(xù)的飼養(yǎng)層細胞。（2）小鼠脾臟中B細胞的分離：該步驟和后續(xù)從扁桃體中分離B細胞的過程類似，此處不再敘述，詳細見下文或者參考文獻[3]。 ① 去除飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)液，加入35 mL含1 ng/mL IL-4的B細胞培養(yǎng)基（RMPI-1640完全培養(yǎng)基，含10% FBS，10 Mm HEPES，1 mM丙酮酸鈉，5.5×10-5 M 2-巰基乙醇，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），加入5 mL細胞懸液至培養(yǎng)皿，細胞接種密度見上表。置于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)4天。② 細胞收集：小心吸去培養(yǎng)皿中細胞培養(yǎng)液，保留約0.5 cm高度的殘液，收集至離心管中。培養(yǎng)皿中加入4 mL MACS緩沖液，靜置3-5 min至細胞分散，收集該部分緩沖液。再用5 mL MACS緩沖液洗滌培養(yǎng)皿，一并收集。注：MACS緩沖液指的是含0.5% BSA以及2 mM EDTA的PBS溶液。 ③ 細胞離心后棄上清，以10 mL B細胞培養(yǎng)基重懸細胞后進行計數。鏡下可以觀察到GCB細胞體積明顯小于40LB細胞。④ 將B細胞接種至新的飼養(yǎng)層細胞上，根據①中步驟繼續(xù)培養(yǎng)。 ① 在步驟（3）操作②完成后可進行飼養(yǎng)層細胞去除。② 棄上清，加入260 μL含生物素標記的抗H-2Kd抗體，小心打勻后，置于室溫條件下孵育20 min。④ 棄上清，加入50 μL鏈霉素顆粒以及100 μL MACS緩沖液，小心打勻后，置于室溫條件下孵育20 min。⑤ 過柱收集細胞，用合適體積的B細胞培養(yǎng)基重懸細胞后進行計數。 評價：和方法一，該方法也是利用CD40/CD40L系統來對B細胞進行體外擴增培養(yǎng)，但是該方法還介紹了后續(xù)飼養(yǎng)層細胞的去除步驟，大家可根據實驗目的自行選做。原理：EB病毒是一種DNA病毒，首次于Burkitt淋巴瘤的淋巴母細胞系中發(fā)現。EBV具有高度的B細胞傾向性，可結合B細胞表面的CD21受體（即補體C3d片段的受體），同時HLA-Ⅱ可作為其共受體。在體外感染B細胞后能夠刺激其持續(xù)生長并誘導永生化，從而形成淋巴母細胞樣細胞系（LCLs）。病毒轉化后的LCLs具有淋巴母細胞和活化B細胞表型：高表達B細胞活化標記物CD23、粘附分子（LFA1、LFA3、ICAM1）以及MHC-I類和II類分子。目前實驗中最常用于產生LCLs的EBV菌株來自絨猴細胞系B95-8或者是Burkitt淋巴瘤Akata細胞株。利用EB病毒促進B淋巴細胞的轉化實驗步驟大致如下[4]：（1）EBV上清制備（根據實驗室現有條件，自主選擇A或B病毒的制備方式）A：利用B95-8細胞系制備病毒上清： B95-8細胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%FBS，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）培養(yǎng)，當細胞達到指數生長期時，將細胞離心后進行傳代培養(yǎng)。用RPMI-1640完全培養(yǎng)基（此時FBS濃度降至2%，B95-8細胞系在低血清濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，會產生大量感染性病毒顆粒）調整細胞密度至2×105/mL，置于37℃，5% CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)14 天，期間不更換培養(yǎng)基。14天后，收集細胞培養(yǎng)上清，4℃ 1800 rpm離心15 min除去細胞及碎片，用0.22 μm的無菌濾膜過濾，分裝成1mL/支，-80℃保存。以該方法制備的EBV上清液不經濃縮可直接用于LCLs生產。B：利用Akata細胞系制備EBV：依據標準細胞培養(yǎng)方案，使用Akata細胞培養(yǎng)Akata細胞。細胞離心后，調整細胞密度至4×106/mL，在培養(yǎng)基中加入濃度為50 μg/mL的抗人IgG抗體（Akata可以通過表面免疫球蛋白交聯誘導EBV產生），并在37℃條件下孵育4 h，誘導細胞進入裂解周期。孵育結束后，加入等量的培養(yǎng)基，調整細胞密度至2×106/mL，繼續(xù)培養(yǎng)5天。5天后，收集細胞培養(yǎng)上清，4℃ 1800 rpm離心15 min除去細胞及碎片，用0.22 μm的無菌濾膜過濾，分裝成1mL/支，-80℃保存。以該方法制備的EBV上清液不經濃縮可直接用于LCLs生產，并且病毒滴度高于利用B95-8細胞系制備的EBV滴度。（2）PBMC分離：有關PBMC的分離，我們已在CD107a：免疫細胞活性評價的又一利器——CD107a 流式檢測方法與知識大放送一文中進行過詳細地介紹。（3）LCLs制備：LCLs的制備也有兩種方式可以選擇A：將EBV上清液與含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基以1:2混合，用該混合液將PBMC細胞密度調整至1×106/mL，同時培養(yǎng)液中添加0.1 g/mL的CyA，以1mL/孔接種至24孔板中，置于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)18-24 h后，棄上清，用含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，每周半量換液。B：將（2）中的PBMC重新懸浮在3–5 mL 經B95-8制備的上清液或1–2 mL經 Akata制備的的上清液中，控制細胞密度在3-5×106，于37℃條件下培養(yǎng)2 h。離心棄去上清，用含10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含0.4 μg/mL的CyA）重懸細胞，控制細胞密度在5×105/mL。以1mL/孔接種至48孔板中，置于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng), 每周半量換液。大約3周后，EBV轉化的B細胞開始生長，當細胞生長狀態(tài)好時，可以將細胞逐漸轉移至24孔板，12孔板，以及75 cm2的燒瓶中進行培養(yǎng)。大約5-6周后，LCLs可以穩(wěn)定并持續(xù)生長。注：環(huán)孢菌素A（CyA）的加入可以抑制T細胞的活性，提高B細胞的轉化率。一方面，如果供血者曾經感染過EBV，那么分離得到的PBMC中會含有部分針對EBV的記憶T細胞，當其被EBV感染的B細胞激活后會對LCLs產生細胞毒作用。CyA濃度可以通過預實驗進行摸索。如果是從臍血中分離得到的PBMC通常不用添加CyA，因其缺乏EBV特異性的記憶T細胞。另一方面，CD4+ T細胞也可以通過CD95和CD95配體介導永生化B細胞的凋亡，導致LCLs建立失敗。因此需要添加CyA支持B細胞的生長。 四、B細胞的體外培養(yǎng)來源很多，最常見的是分離自外周血和扁桃體，在此我挑選了一篇文章給大家講講如何從扁桃體中分離GCB細胞。實驗步驟如下[5]：（1）從新鮮采集的人扁桃體中分離出1cm3大小左右的淋巴組織，然后使用無菌手術刀將其切割成3-5 mm的小塊，保證無黏膜組織殘留。（2）將小組織塊置于70 μm的細胞篩中，隨后置于10 cm培養(yǎng)皿中，加入10 mL培養(yǎng)基或PBS。使用5 mL注射器柱塞的粗糙端輕輕研磨組織塊，通過濾器分離小扁桃體碎片。（3）轉移細胞懸液至15 mL離心管中，并用5 mL培養(yǎng)基或PBS沖洗培養(yǎng)皿和細胞篩，一并轉移至離心管中，室溫條件下400 g離心4分鐘。此時沉淀物體積應該在0.5-1 mL左右，并可見大量紅細胞。
圖4 自扁桃體分離GCB細胞流程示意圖 （4）棄上清，用10 mL MACS緩沖液重懸細胞，室溫條件下400 g離心4分鐘。（5）棄上清，用20 mL MACS緩沖液重懸細胞,。（6）準備兩根15 mL離心管，底部加入5 mL淋巴細胞分離液，小心將10 mL細胞懸液加至分離液上方，室溫條件下800 g離心20分鐘。（7）用移液槍將淋巴細胞層轉移到另外一個15 mL離心管中，用13 mL MACS緩沖液重新懸浮細胞，并進行細胞計數。（8）控制每個離心管內細胞的數量在2×108左右，4℃條件下400 g離心4分鐘。（該步驟及后續(xù)須在4℃條件下進行操作，該步驟結束后注意留出一部分用作流式細胞術細胞純化前的對照）（9）棄上清，將細胞重懸在800μL的MACS緩沖液中，加入100 μL B細胞去除試劑，以及生物素化的IgD和CD44抗體各1 μL。② 非naive B（包括GCB和記憶B細胞）：不添加CD44抗體。（10）置于冰上孵育25分鐘，間歇混勻細胞混合液。（11）加入10 mL MACS緩沖液，4℃條件下400 g離心4分鐘。（12）棄上清，加入800 μL MACS緩沖液以及 200 μL抗生物素珠，輕輕混合。（14）加入10 mL MACS緩沖液后，4℃條件下400 g離心4分鐘。離心過程中，組裝MACS磁力架和LS柱，以3 mL MACS緩沖液預過LS柱，棄流通液。（15）離心結束后，加入1 mL MACS緩沖液重懸細胞，隨后加入到LS柱中，以15 mL離心管收集流通液，置于冰上。（16）通過離心（400g，4分鐘，4°C）從收集的流通液中分離出細胞，棄上清液，沉淀物中即含有純化的GCB細胞，用于后續(xù)GCB細胞的培養(yǎng)或者GCB細胞純度的評價。① 步驟8和16中獲得的細胞懸液置于4℃條件下400 g離心4分鐘；② 用100 μL FACS緩沖液重懸細胞，加入0.1-10 μg/mL的主要標記抗體（CD20、CD19、CD38、CD10），置于4℃條件下孵育30 min。③ FACS緩沖液洗滌細胞一次，隨后用200-500μL FACS緩沖液重懸細胞；
圖5 純化前后B細胞的富集情況 本文后續(xù)，作者還通過飼養(yǎng)層細胞支持GCB細胞體外擴增培養(yǎng)，以及利用CRISPR-Cas9技術，對GCB細胞基因表達進行操控，進而在體外模擬惡性淋巴瘤中由于常見基因突變導致的B細胞永生化現象，為惡性淋巴瘤的遺傳學的研究提供了一種工具。詳細的內容大家可以參考文獻[5]，這邊就不再敘述啦。
圖6 利用基因操控技術誘導B細胞的永生化 最后，還有研究表明，Bcl-6基因表達沉默是記憶B細胞形成所必須的。體外過表達Bcl-6可以阻止B細胞向記憶B細胞的分化，感興趣的讀者可以對參考文獻[6]詳細閱讀。1. Helm, M., et al., Isolation of primary human B lymphocytes from tonsils compared to blood as alternative source for ex vivo application. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies In the Biomedical and Life Sciences, 2021. 1179: p. 122853.2. Su, K.-Y., et al., Efficient Culture of Human Naive and Memory B Cells for Use as APCs. Journal of Immunology (Baltimore, Md. : 1950), 2016. 197(10): p. 4163-4176.3. Haniuda, K., T. Nojima, and D. Kitamura, In Vitro-Induced Germinal Center B Cell Culture System. Methods In Molecular Biology (Clifton, N.J.), 2017. 1623: p. 125-133.4. Nagy, N., Establishment of EBV-Infected Lymphoblastoid Cell Lines. Methods In Molecular Biology (Clifton, N.J.), 2017. 1532: p. 57-64.5. Caeser, R., et al.,Genetic manipulation and immortalized culture of ex vivo primary human germinal center B cells. Nature Protocols, 2021. 16(5): p. 2499-2519.6. Kuo, T.C., et al., Repression of BCL-6 is required for the formation of human memory B cells in vitro. The Journal of Experimental Medicine, 2007. 204(4): p. 819-830
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