【原】外周血中PBMC細(xì)胞的分離流程

健明 2021-09-24

展開全文

血液組織介紹

血液做為循環(huán)流動在心血管系統(tǒng)內(nèi)的紅色不透明黏稠液態(tài)結(jié)締組織，其主要由血漿和血細(xì)胞組成。其中血漿作為運載細(xì)胞，營養(yǎng)物質(zhì)及代謝物的循環(huán)液體，主要成分是水（約占90%），其次是細(xì)胞蛋白，酶，激素等物質(zhì)；另外的一部分是血細(xì)胞主要包含紅細(xì)胞，白細(xì)胞及血小板三個大類。血液中血細(xì)胞的形態(tài)，數(shù)量，比例與血紅蛋白含量稱血象，很多疾病都會伴隨血象的變化，所以血象檢測也做為體外診斷篩查的一種重要形式。

在血細(xì)胞中存在著參與機(jī)體免疫應(yīng)答，調(diào)控相關(guān)的一類細(xì)胞，我們統(tǒng)稱為外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，是外周血中具有單個核的細(xì)胞（Mononuclear cell），包含了淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（Monocyte）。因外周血中具有單個核的細(xì)胞在機(jī)體免疫中的重要性，所以單個核的血細(xì)胞成為很多科研工作者重點關(guān)注和研究的對象。

根據(jù)單個核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞的比重在1.092左右，單個核細(xì)胞的比重為1.075-1.090，血小板為1.030-1.035。因此利用一種介于1.075-1.092之間而近于等滲的溶液（密度梯度分離液或分層液）作密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，可將各種血細(xì)胞與單個核細(xì)胞分離。

參考耗材、試劑和儀器

實驗步驟

樣本準(zhǔn)備：4 mL 全血/每樣，正式分離 PBMC 時使用 2 mL，分兩管進(jìn)行；剩余 2 mL 留做備用。
在室溫平衡血液和 Ficoll(樣本密度分離液) 30 min；冰上操作以下實驗，在 15 mL 離心管中一次分別加入外周血和1× DPBS（外周血：1×DPBS=1：1）各 1mL，移液槍輕輕吹打5次稀釋混勻。
另取一只 15 Ml 離心管向底部添加 2 mL Ficoll (樣本密度分離液)，傾斜離心管至 30-45 度角，吸取 2 mL 1×DPBS 稀釋的血液緩慢加入到 Ficoll (樣本密度分離液)上層。
將 15 Ml 離心管輕柔轉(zhuǎn)移到高速冷凍離心機(jī)中，設(shè)置提速加速度設(shè)置為 9，減速加速度設(shè)置為 1，離心力 700 g ，溫度20℃ 離心 20 min。
離心完成后吸取 PBMC 細(xì)胞層（如下圖）的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至 15 Ml 離心管中，在離心管中加入 6 Ml 的 1640 (含5% FBS) 培養(yǎng)基，使用巴斯吸管輕柔吹打細(xì)胞懸液 3-5 次，重懸細(xì)胞。
紅細(xì)胞裂解：離心完成后，從離心機(jī)中取出離心管，觀察離心后的細(xì)胞沉淀，如果細(xì)胞沉淀中有紅色，準(zhǔn)備進(jìn)行紅細(xì)胞裂解操作（參看裂紅步驟I，II，III）；收集后的細(xì)胞沉淀中沒有紅色，則可以不進(jìn)行裂紅處理，直接進(jìn)入下一步。

紅細(xì)胞裂解：
I．使用寬口槍頭棄上清，加入300μl 1640培養(yǎng)基（含5%FBS）輕輕重懸細(xì)胞，后加入紅細(xì)胞裂解液3mL，置于4℃（冰上），裂紅計時 3min；如細(xì)胞懸液中紅細(xì)胞較多（如：PBMC）可以適當(dāng)延長裂紅時間至5min。
II．裂紅后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移進(jìn)高速冷凍離心機(jī)（12℃，300g，5min）中低溫離心收集細(xì)胞；如若細(xì)胞懸液中還有肉眼可見的紅細(xì)胞沉淀摻雜其中，可重復(fù)步驟I，但裂紅時間不可超過5min。
III．裂紅完成后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移進(jìn)高速冷凍離心機(jī)（12℃，300 g,5 min）中低溫離心收集細(xì)胞。

清洗：離心完成后，從離心機(jī)中取出富集了細(xì)胞沉淀的離心管，巴斯吸管棄除上清；加入3mL-5mL 的1640（含5%FBS）培養(yǎng)基(注：按照每個米粒大小的細(xì)胞沉淀用量3mL的參考標(biāo)準(zhǔn)加入清洗培養(yǎng)基)，使用寬口槍頭（或巴氏吸管）重懸細(xì)胞后，高速冷凍離心機(jī)（12℃，300g,5min）中低溫離心收集細(xì)胞。
重復(fù)1-2次步驟7對細(xì)胞進(jìn)行清洗去除背景，清洗后的細(xì)胞懸液使用1640（含5%FBS）的培養(yǎng)基(注：按照每個米粒大小的細(xì)胞沉淀用量150μl的參考標(biāo)準(zhǔn)加入重懸培養(yǎng)基；如遇細(xì)胞量極少，甚至肉眼無法看到時可用60μl)重懸，置于冰上待計數(shù)上機(jī)。