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多能干細胞（Pluripotent stem cells，PSCs）因在體外具無限增殖和分化為不同類型細胞的潛能，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中頗具應(yīng)用前景，也成為目前臨床上最具潛能的成藥細胞。PSCs制備過程中的標準化、規(guī)?；凹毎|(zhì)量穩(wěn)定性是走向臨床應(yīng)用的先決條件，但人PSCs在體外擴增培養(yǎng)過程中，易出現(xiàn)遺傳和表觀遺傳的變異，嚴重阻礙了PSCs的臨床應(yīng)用。因此，研究PSCs遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性維持機理，是尋找改善策略、突破應(yīng)用瓶頸的關(guān)鍵。 PSCs基因組的突變率遠低于分化細胞。中國科學(xué)院昆明動物研究所研究員鄭萍團隊與合作者的前期研究表明，PSCs利用不同于體細胞的特殊機制，有效調(diào)控基因組穩(wěn)定。鄭萍團隊前期已鑒定了PSCs在DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)中的一些特殊分子及作用機制。近期，科研團隊鑒定了在小鼠胚胎干細胞（mouse Embryonic Stem cells，mESCs）中特異表達的全新長鏈非編碼RNA-LncRNA NONMMUT028956（簡寫為Lnc956）。對該LncRNA的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，它不僅參與復(fù)制壓力下mESCs復(fù)制小體穩(wěn)定的維持，而且還監(jiān)控mESCs基因組的質(zhì)量，從而確保mESCs基因組穩(wěn)態(tài)。 長非編碼RNA在多種生物學(xué)功能中起重要作用。由于技術(shù)手段的限制，目前尚未有發(fā)現(xiàn)復(fù)制叉上具功能性長非編碼RNA的報道。科研團隊利用前期研發(fā)的分離新生DNA鏈上（即復(fù)制叉）RNA技術(shù)（isolate RNAs on nascent DNA，iROND)，首次鑒定了ESCs復(fù)制叉上特異的新的功能性LncRNA-Lnc956。對該LncRNA的研究發(fā)現(xiàn)，當復(fù)制壓力發(fā)生時，Lnc956能有效聚集到復(fù)制叉上，并大量招募Trim28和Hsp90b1聚集于復(fù)制叉形成復(fù)合體。Trim28直接與DNA復(fù)制解旋酶復(fù)合體MCM2-7相互作用，拉近了Lnc956-Trim28-Hsp90b1復(fù)合體與MCM2-7復(fù)合體之間的物理距離，使分子伴侶Hsp90b1通過GTP水解活性作用于MCM7，阻礙MCM7進行K48和K63泛素化（MCM7泛素化會導(dǎo)致復(fù)制小體解離），從而使復(fù)制小體能在一定程度復(fù)制壓力情況下得以穩(wěn)定，保持了基因組的完整性?？蒲袌F隊也發(fā)現(xiàn)Lnc956缺失會導(dǎo)致小鼠胚胎部分致死。致死原因主要是胚胎細胞大量擴增過程中，細胞出現(xiàn)明顯基因組不穩(wěn)定現(xiàn)象，并導(dǎo)致胞質(zhì)DNA水平顯著增加，引起較嚴重的炎癥反應(yīng)?？傊?，該研究成果迄今首次發(fā)現(xiàn)了小鼠多能干細胞復(fù)制叉上特異性功能性長非編碼RNA-Lnc956，并揭示了Lnc956維持多能干細胞基因組穩(wěn)定和促進胚胎發(fā)育的分子機制。 有效清除基因組損傷的細胞個體，是干細胞維持群體基因組穩(wěn)定的重要方式。p53是目前已知唯一的干細胞基因組質(zhì)量監(jiān)控分子。p53通過在轉(zhuǎn)錄水平上抑制多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因的表達，激活分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基因的轉(zhuǎn)錄，使PSCs快速啟動分化和凋亡，確保PSCs的基因組質(zhì)量。除了p53通路，是否還存在其他獨立的機制調(diào)控損傷干細胞的清除，值得進一步研究。 科研團隊針對新鑒定的LncRNA-Lnc956在干細胞質(zhì)量控制中發(fā)揮的作用做了深入探索。利用多種DNA損傷藥物處理、分化、凋亡、單克隆形成、克隆競爭性和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法對該LncRNA功能研究后，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)缺失Lnc956的ESCs在受到DNA損傷后不易啟動分化和凋亡，提示Lnc956參與DNA損傷后ESCs的分化和凋亡。但是，Lnc956缺失的ESC中，p53通路的激活和功能未受影響，提示p53沒有介導(dǎo)Lnc956的調(diào)控作用。為探究Lnc956分子水平上具體作用機理，科研人員利用In vitro/in vivo RNA pull down、蛋白質(zhì)質(zhì)譜及RNA免疫共沉淀等技術(shù)鑒定出與Lnc956相互作用的靶蛋白-KLF4?？蒲袌F隊通過機制分析發(fā)現(xiàn)，在未受DNA損傷時，Lnc956與KLF4無相互作用。而在基因組受損后，DNA損傷反應(yīng)通路的核心激酶ATM激活，ATM活化Mettl3 (調(diào)控RNA m6A修飾），使Lnc956發(fā)生m6A修飾。發(fā)生m6A修飾的Lnc956大量結(jié)合干性維持關(guān)鍵蛋白KLF4。Lnc956-KLF4結(jié)合體滯留KLF4蛋白，阻止KLF4蛋白對ESCs多能性的調(diào)控，阻止KLF4蛋白結(jié)合到DNA上行使干性調(diào)控功能，使基因組損傷的干細胞快速發(fā)生分化，得以清除。Lnc956-KLF4通路不依賴p53，和p53通路平行，共同對干細胞基因組質(zhì)量進行監(jiān)控。因此，當ESCs受到DNA損傷應(yīng)激時，磷酸化的ATM信號通路可分別激活p53和Lnc956-KLF4兩條通路，使未受DNA損傷修復(fù)的ESCs快速發(fā)生分化和凋亡，高效清除受損ESCs，防止受損ESCs傳遞到子代，確保了ESCs遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和安全性。 相關(guān)研究成果分別以Lnc956-TRIM28-HSP90B1 complex on replication forks promotes CMG helicase retention to ensure stem cell genomic stability and embryogenesis和Lnc956 regulates mouse embryonic stem cell differentiation in response to DNA damage in a p53-independent pathway為題，發(fā)表在《科學(xué)進展》（Science Advances)上。研究工作得到國家自然科學(xué)基金等的支持。
圖1.Lnc956維持復(fù)制叉穩(wěn)定促進多能干細胞基因組穩(wěn)定的分子機制   |
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