發(fā)育生物學(xué)家一直以來(lái)最關(guān)心的問(wèn)題，就是各種信號(hào)通路如何對(duì)胚胎發(fā)育和器官形成進(jìn)行精確的時(shí)空調(diào)控。近年來(lái)，CRISPR相關(guān)的基因編輯技術(shù)為研究人的發(fā)育提供了很好的平臺(tái)。例如近期，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)激活素A（Activin A）可以誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞（ESC）分化為定形內(nèi)胚層（definitive endoderm，DE）細(xì)胞【1】，這是通過(guò)Nodal-TGF-β信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的【2】。然而緊接而來(lái)的問(wèn)題則是Nodal-TGF-β信號(hào)如何在ESC中同時(shí)起到保持干細(xì)胞多能性，和促進(jìn)內(nèi)胚層分化這兩個(gè)似乎相互矛盾的作用。此外，使用激活素A促進(jìn)分化的效率在不同干細(xì)胞系中也并不一致，說(shuō)明人們對(duì)于該通路調(diào)控分化的機(jī)理仍有未知之處。

2019年5月21日，來(lái)自紀(jì)念斯隆凱特琳的研究者Danwei Huangfu和來(lái)自約翰霍普金斯大學(xué)的Michael Beer共同在Nature Genetics雜志發(fā)表題為Genome-scale screens identify JNK–JUN signaling as a barrier for pluripotency exit and endoderm differentiation的文章。他們利用CRISPR／Cas技術(shù)篩選出調(diào)控DE分化的JNK-JUN通路，并闡釋了了JNK-JUN通路是通過(guò)結(jié)合ESC啟動(dòng)子來(lái)進(jìn)行調(diào)控的。

研究者設(shè)計(jì)了由7萬(wàn)6千個(gè)余gRNA組成的文庫(kù)，將它們轉(zhuǎn)入ESC，靶向全基因組的每個(gè)基因。在激活基因編輯之后，他們使用激活素A和CHIR99021（GSK3抑制劑）誘導(dǎo)ESC向DE分化。接著他們以SOX17基因的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，使用FACS將分化和未分化的細(xì)胞分開(kāi)。研究者通過(guò)比較兩種細(xì)胞中各種gRNA的比例發(fā)現(xiàn)了37個(gè)正向調(diào)控因子（促進(jìn)分化）和28個(gè)逆向調(diào)控因子（阻止分化），并依次確認(rèn)了其中的絕大部分。

正向調(diào)控因子主要由DE轉(zhuǎn)錄因子、Nodal-TGF-β通路、WNT通路、Hippo通路等已知通路中的因子組成。然而在6個(gè)FDR<0.05的逆向調(diào)控因子中，有4個(gè)都處在JNK-JUN通路中，包括MEKK1、MKK4、MKK7和JUN。作為驗(yàn)證，研究者通過(guò)基因敲除和藥物抑制使JNK-JUN通路失活，這也直接導(dǎo)致了DE的分化率大幅上升至90%以上。

JNK-JUN通路之前并未被認(rèn)為是細(xì)胞分化的調(diào)控因子。因此研究者進(jìn)一步探索了其調(diào)控的機(jī)理，尤其是它同Nodal-TGF-β-SMAD2/3通路的關(guān)系。研究者首先分析了SMAD2/3的ChIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在ESC中OCT4/NANOG的motif在SMAD2/3結(jié)合位點(diǎn)最為富集，而在DE中GATA6的motif最富集。接著研究者加入了JNK抑制劑（JNKi），并對(duì)JNKi細(xì)胞進(jìn)行ATAC-seq測(cè)序。他們使用gkm-SVM工具比較了JNK抑制后染色質(zhì)開(kāi)放性上升和下降的位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)SMAD2/3常常與那些染色質(zhì)開(kāi)放性下降的位點(diǎn)結(jié)合。對(duì)SMAD2/6和GATA6的ChIP-seq顯示，JNKi使得DE中那些開(kāi)放性上升的位點(diǎn)結(jié)合了更多的SMAD2/6和GATA6因子。研究者據(jù)此推斷，JUN的功能是穩(wěn)定ESC增強(qiáng)子，而JNKi則使這些增強(qiáng)子失活。

研究者接著將注意力集中在ESC和DE的增強(qiáng)子上。分析顯示JUN傾向于和OCT4、NANOG與SMAD2/3一起結(jié)合在ESC啟動(dòng)子周圍。JNKi降低了ESC中被JUN結(jié)合的啟動(dòng)子區(qū)域的開(kāi)放性，同時(shí)增加了DE中被JUN結(jié)合的啟動(dòng)子區(qū)域的開(kāi)放性。因此JNKi導(dǎo)致了SMAD2/3因子的重新分布。同時(shí)那些在JNKi后開(kāi)放性降低的區(qū)域附近，也常常存在分化后表達(dá)水平下降的基因。

綜上，JNK-JUN通路的功能并不是直接抑制DE增強(qiáng)子。相反，JUN結(jié)合ESC啟動(dòng)子和SMAD2/3因子，JNK-JUN通路保護(hù)了ESC基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性。這項(xiàng)工作也揭示了CRISPR全基因組篩查在發(fā)育生物學(xué)研究中的價(jià)值。

原文鏈接：

https:///10.1038/s41588-019-0408-9

1. D’Amour, K. A. et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat. Biotech. 23, 1534–1541 (2005).

2. Robertson, E. J. Dose-dependent Nodal/Smad signals pattern the early mouse embryo. Semin. Cell Dev. Biol. 32, 73–79 (2014).