中國(guó)科學(xué)院北京生科院孫中生團(tuán)隊(duì)、溫州醫(yī)科大學(xué)、首都兒科研究所合作，在Advanced Science上，在線發(fā)表了題為L(zhǎng)oss-of-Function of p21-Activated Kinase 2 Links BMP Signaling to Neural Tube Patterning Defects的研究論文。該研究聚焦神經(jīng)管畸形的致病機(jī)制，綜合運(yùn)用神經(jīng)生物學(xué)、人類(lèi)遺傳學(xué)、多組學(xué)等技術(shù)手段，在多種模式生物中揭示了PAK2調(diào)節(jié)背外側(cè)鉸鏈點(diǎn)形成和神經(jīng)管發(fā)育及其功能異常所致神經(jīng)管畸形的致病機(jī)理，為探究神經(jīng)管畸形的病理機(jī)制提供了嶄新視角。

神經(jīng)管是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)，在胚胎后期發(fā)育成腦和脊柱。在脊椎動(dòng)物中，神經(jīng)管閉合是高度復(fù)雜的動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程，涉及許多由遺傳和表觀遺傳因素精確控制的細(xì)胞事件。神經(jīng)管閉合異常會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)管畸形。神經(jīng)管畸形致死率和致畸率較高，給患者家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)與精神負(fù)擔(dān)。神經(jīng)管畸形是胎兒和新生兒中最嚴(yán)重的出生缺陷類(lèi)疾病之一。 

PAK家族是一類(lèi)可以調(diào)控細(xì)胞骨架的蛋白激酶。該團(tuán)隊(duì)的前期研究確定了PAK2在腦發(fā)育中的重要功能，并闡明了PAK2在自閉癥發(fā)病中的分子機(jī)制（Wang et al., 2018）。本研究發(fā)現(xiàn)Pak2純和缺失小鼠在胚胎期9.5天時(shí)發(fā)育遲緩，表現(xiàn)出顱脊柱裂的表型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎期9.5天時(shí)，Pak2純和缺失小鼠未能在后腦和脊柱部位抬起雙側(cè)神經(jīng)板，導(dǎo)致背外側(cè)鉸鏈點(diǎn)形成失敗。這提示PAK2基因?qū)τ谡麄€(gè)頭尾胚軸的背外側(cè)彎曲是必要的。研究通過(guò)分析胚胎期9.5天的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，Pak2純和缺失小鼠的差異表達(dá)基因顯著富集到初級(jí)神經(jīng)管形成、前腦、中腦、后腦發(fā)育、模式特化過(guò)程和脊柱發(fā)育過(guò)程。這些差異表達(dá)基因還顯著地富集于BMP信號(hào)通路。BMP信號(hào)通路的多個(gè)配體，如BMP4/5和下游Smad9的磷酸化水平，均在Pak2純和缺失小鼠中顯著增加?？蒲袌F(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將Smad9蛋白417位點(diǎn)絲氨酸突變后可減弱PAK2和Smad9蛋白的相互作用，并解除PAK2對(duì)Smad9蛋白465位點(diǎn)絲氨酸磷酸化的抑制。上述工作提示PAK2可通過(guò)調(diào)控Smad9蛋白的磷酸化水平，從而抑制BMP信號(hào)通路，促使雙側(cè)神經(jīng)板的抬起和神經(jīng)管背外側(cè)鉸鏈點(diǎn)形成。 

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步顯示，Pak2純和缺失后可影響中胚層細(xì)胞向神經(jīng)管及前腦和脊柱的分化軌跡，使得與神經(jīng)管和神經(jīng)管發(fā)育而成的前腦、后腦、脊柱等相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型顯著下降。與野生型胚胎相比，Pak2純和缺失胚胎的神經(jīng)管發(fā)育分?jǐn)?shù)及前腦（尤其是間腦部分）發(fā)育分?jǐn)?shù)降低。同時(shí)，BMP信號(hào)通路及該信號(hào)通路中的基因表達(dá)在Pak2純和缺失胚胎中增加。這提示Pak2純和缺失胚胎中異常的分化時(shí)序與異常的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)相關(guān)。 

該團(tuán)隊(duì)在流產(chǎn)的神經(jīng)管畸形胎兒中檢測(cè)到5個(gè)位于PAK2基因的點(diǎn)突變。研究運(yùn)用NanoString檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)攜帶PAK2突變的胎兒腦組織中PAK2的水平降低而B(niǎo)MP信號(hào)通路中多個(gè)基因的水平增加。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)PAK2突變點(diǎn)可影響PAK2蛋白的穩(wěn)定性，抑制ATP轉(zhuǎn)化ADP的水平，顯著降低PAK2的活性形式pPAK2的水平，提示該突變位點(diǎn)影響PAK2激酶活性。 

研究在斑馬魚(yú)中用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了pak2a的特異敲除模型。該模型在出生后48小時(shí)后在頭部背前側(cè)區(qū)域出現(xiàn)了一個(gè)明顯的空腔，提示其神經(jīng)管發(fā)育異常。研究在敲除pak2a的斑馬魚(yú)中過(guò)表達(dá)神經(jīng)管畸形患者攜帶的PAK2突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)不能改善斑馬魚(yú)神經(jīng)管畸形的表型。 

綜上，該研究以神經(jīng)管特定發(fā)育事件（背外側(cè)鉸鏈點(diǎn)形成）為出發(fā)點(diǎn)、從細(xì)胞動(dòng)態(tài)時(shí)序發(fā)育過(guò)程（單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)）、分子機(jī)制（磷酸化激酶活性）和信號(hào)通路（BMP通路）等多水平，在多種脊椎類(lèi)生物中闡明了PAK2在神經(jīng)管發(fā)育的作用機(jī)制。 

圖1.Pak2純和缺失胚胎中異常的分化時(shí)序