小細(xì)胞肺癌（SCLC）約占所有肺癌的10～15%，且惡性程度高、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散較早，大多數(shù)SCLC患者確診時(shí)已有轉(zhuǎn)移(1)。SCLC患者初期對(duì)鉑類化療藥很敏感，但也較易出現(xiàn)耐藥，雖然一部分患者能夠受益于化療和免疫療法的“攜手抗敵”，但且生存期超過1～2年的患者極少(2)，仍需尋找指導(dǎo)臨床決策的生物標(biāo)志物(3)。

近年來研究根據(jù)不同主要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)將SCLC分為四個(gè)亞型，不同亞型呈轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異性表現(xiàn)，且隨著治療出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化(4, 5)。然而，上述的轉(zhuǎn)錄亞型與患者預(yù)后相關(guān)性尚不清楚。為解決這個(gè)問題，科研人員們將目光瞄向了近年火熱的液體活檢，而在SCLC發(fā)展過程中作用重要的DNA甲基化就可以成為目標(biāo)(6)。

近日，來自英國曼徹斯特大學(xué)的Caroline Dive、Dominic G. Rothwell和來自美國紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心的Charles M. Rudin帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)，就研發(fā)了一套無創(chuàng)性、靈敏且應(yīng)用范圍廣泛的檢測全基因組DNA甲基化的流程，通過檢測患者外周血游離DNA（cfDNA）甲基化情況，指導(dǎo)SCLC分期、分型鑒定以及疾病監(jiān)控，研究發(fā)表在了Nature Cancer上。

那么，這項(xiàng)有望進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化的技術(shù)手段是怎么來的，又將如何應(yīng)用呢？

研究人員首先在二代測序（NGS）的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了T7-MBD-seq測序方法。利用此方法對(duì)97例SCLC患者來源腫瘤組織異體移植組織（PDX）或循環(huán)腫瘤細(xì)胞來源移植組織（CDX）和13例健康肺組織進(jìn)行測序。

測序結(jié)果顯示，CDX/PDX和健康肺組織的甲基化模式存在明顯的不同，且這一方法所測結(jié)果與利用Illumina平臺(tái)對(duì)原發(fā)腫瘤和健康肺組織測序結(jié)果相一致，提示了T7-MBD-seq測序方法的可靠性（圖1）。

圖1. T7-MBD-seq與Illumina平臺(tái)對(duì)不同SCLC腫瘤組織和正常肺組織甲基化測序結(jié)果一致

研究人員進(jìn)一步利用此方法，對(duì)78例SCLC患者和79例非腫瘤來源的cfDNA進(jìn)行測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此方法可對(duì)1.83-34.4 ng的cfDNA進(jìn)行測序，且甲基化富集分?jǐn)?shù)與50 ng CDX/PDX樣本相近（圖2左）。同時(shí)，同一患者來源CDX和cfDNA的測序結(jié)果也顯示，甲基化模式高度一致（圖2右）。以上結(jié)果提示，應(yīng)用T7-MBD-seq測序方法檢測cfDNA甲基化，并將其作為SCLC患者的診斷標(biāo)志物，具有可靠的發(fā)展前景。

圖2. 1.83-34.3 ng cfDNA與50 ng CDX/PDX標(biāo)本所測甲基化模式相近（左）；同一患者來源cfDNA與CDX所測甲基化模式高度一致（右）

在此基礎(chǔ)上，研究人員利用更多的樣本數(shù)據(jù)反復(fù)訓(xùn)練該方法模型，隨后對(duì)119例cfDNA樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該模型能夠高效區(qū)分SCLC患者與正常肺組織人群，甚至能夠區(qū)分出SCLC患者是處在局限期（LS-SCLC）還是廣泛期（ES-SCLC），準(zhǔn)確率分別高達(dá)93%和100%（圖3）。

圖3. T7-MBD-seq檢測cfDNA甲基化準(zhǔn)確區(qū)分健康肺組織人群和局限期、廣泛期SCLC患者

而按照患者的疾病分期不同來劃分時(shí)，cfDNA甲基化檢測相對(duì)細(xì)胞拷貝數(shù)變異（CNA）檢測（圖4），在檢測LS-SCLC的靈敏度和特異性上明顯更優(yōu)，這就提示cfDNA甲基化檢測更有利于篩查出較早期、低腫瘤負(fù)荷的SCLC患者。

圖4. T7-MBD-seq檢測cfDNA甲基化靈敏度優(yōu)于拷貝數(shù)變異檢測

為進(jìn)一步挖掘cfDNA甲基化檢測的臨床應(yīng)用價(jià)值，研究人員探究了其與SCLC患者生存期的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)cfDNA甲基化分?jǐn)?shù)中位數(shù)將患者分為兩組，甲基化分?jǐn)?shù)低的患者總生存期要顯著長于甲基化分?jǐn)?shù)高的患者（20.6個(gè)月 vs. 8.5個(gè)月，HR=3.60，見圖5）。

圖5. cfDNA甲基化分?jǐn)?shù)低的患者，則總生存期長

考慮到SCLC分子分型對(duì)SCLC患者的治療、預(yù)后具有重要意義，研究人員又對(duì)模型進(jìn)行了一系列訓(xùn)練，并檢測了cfDNA甲基化與分型的相關(guān)性。結(jié)果顯示，根據(jù)相應(yīng)的cfDNA甲基化檢測情況，有助于準(zhǔn)確區(qū)分患者屬于ASCL1、NEUROD1型還是雙陰性分型（圖6）。

圖6. 根據(jù)cfDNA甲基化檢測情況與已知分子分型進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析

大多數(shù)SCLC患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是進(jìn)展期、出現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，預(yù)后不夠理想。因此，挖掘能夠輔助早期診斷及監(jiān)測這一疾病進(jìn)展的無創(chuàng)性生物指標(biāo)及相關(guān)檢測方法將無形中挽救許多肺癌患者的生命，同時(shí)也將大大降低家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。如果說上述問題是一片荒漠，那么本項(xiàng)研究即是在荒漠中種下一棵樹。

當(dāng)然，本次研究的結(jié)論仍需要更多驗(yàn)證，尤其是在更大的患者隊(duì)列中驗(yàn)證，提高準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，這樣才能早日將這一技術(shù)手段真正應(yīng)用于臨床，為SCLC患者提供更精準(zhǔn)的治療建議和預(yù)后判斷提供支持。

參考文獻(xiàn):

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4.C. M. Rudin, J. T. Poirier, L. A. Byers, C. Dive, A. Dowlati, J. George, et al. Molecular subtypes of small cell lung cancer: a synthesis of human and mouse model data. Nat Rev Cancer. 2019;19(5):289-97.

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6.A. F. Gazdar, P. A. Bunn, J. D. Minna. Small-cell lung cancer: what we know, what we need to know and the path forward. Nat Rev Cancer. 2017;17(12):725-37.