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細(xì)菌感染每年導(dǎo)致數(shù)十萬(wàn)人死亡，尤其在中低收入國(guó)家?？紤]到過(guò)去50年來(lái)僅有少量抗生素獲批，新抗生素的發(fā)展還面臨著細(xì)菌包膜的低滲透性以及特異性靶標(biāo)少的挑戰(zhàn)。病原體對(duì)現(xiàn)有藥物產(chǎn)生耐藥性的速度進(jìn)一步加劇了尋找有效抗菌劑的困難。鑒于這種不平等的軍備競(jìng)賽，細(xì)菌性流行病的卷土重來(lái)是一個(gè)很大的威脅，迫切需要對(duì)抗感染的創(chuàng)新戰(zhàn)略。
藥物發(fā)現(xiàn)中的一個(gè)新興概念是誘導(dǎo)降解靶蛋白。對(duì)于真核生物來(lái)說(shuō)，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與細(xì)胞內(nèi) 80% 以上蛋白質(zhì)的降解。泛素對(duì)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)無(wú)異于“死神來(lái)了”，一旦被盯上，終將被摧毀。
最突出的合成“降解劑”是蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）：雙功能小分子，包括 E3 泛素連接酶結(jié)合部分和靶蛋白（POI）結(jié)合的化學(xué)部分。PROTAC 通過(guò)使 E3 連接酶和 POI 接近，促進(jìn) POI 泛素化和隨后的蛋白酶體降解。
與經(jīng)典抑制劑相比，蛋白質(zhì)降解劑具有多種優(yōu)勢(shì)。例如，基于此種催化模式，它們表現(xiàn)出更高的降解效率。此外，PROTAC 幾乎可以靶向任何細(xì)胞蛋白質(zhì)，并且它們兩個(gè)端口可以進(jìn)行模塊化改造，允許改造蛋白質(zhì)配體以設(shè)計(jì)出針對(duì)特異性靶蛋白的“降解劑”。
盡管有這樣的希望，PROTAC 技術(shù)迄今為止僅限于真核生物的泛素標(biāo)記系統(tǒng)，尚未轉(zhuǎn)移到細(xì)菌的降解途徑中。實(shí)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)的靶蛋白降解將為設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)劑和開(kāi)發(fā)新型抗菌劑提供有吸引力的策略。
近日，奧地利維也納分子病理學(xué)研究所的 Tim Clausen 實(shí)驗(yàn)室與德國(guó)杜伊斯堡-埃森大學(xué)的 Markus Kaiser 實(shí)驗(yàn)室合作，在 Cell 期刊發(fā)表了題為：BacPROTACs mediate targeted protein degradation in bacteria 的研究論文。
該研究開(kāi)發(fā)了一種新型小分子降解劑——BacPROTAC，基于細(xì)菌內(nèi)的 ClpCP 蛋白酶降解系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)的靶蛋白降解，為抗菌劑開(kāi)發(fā)提供了全新策略。
盡管泛素化是真核細(xì)胞獨(dú)有的，但在細(xì)菌體內(nèi)，也存在一種與泛素-蛋白酶類似的蛋白降解系統(tǒng)——ClpC：ClpP（ClpCP）蛋白酶系統(tǒng)3。與識(shí)別復(fù)雜多聚泛素信號(hào)的真核蛋白酶體相比，ClpCP 蛋白酶識(shí)別機(jī)制要簡(jiǎn)單得多：一個(gè)磷酸基團(tuán)連接在靶蛋白的精氨酸殘基上，作為降解信號(hào)被 ClpCP 蛋白酶識(shí)別從而實(shí)現(xiàn)靶蛋白的降解。ClpCP 蛋白酶存在于革蘭氏陽(yáng)性菌和分枝桿菌中，具有作為細(xì)菌蛋白降解劑中蛋白降解元件的潛力。
基于 ClpCP 蛋白酶降解系統(tǒng)，研究者以枯草芽孢桿菌 ClpCP 為蛋白降解原件，重新設(shè)計(jì)了由 POI 配體、化學(xué)接頭和 ClpCNTD 配體組成的 BacPROTAC。
這種模塊化的設(shè)計(jì)方式理論上可以降解細(xì)菌中的任何蛋白質(zhì)。作為概念驗(yàn)證，研究團(tuán)隊(duì)在體外以單體鏈霉親和素（mSA）作為模型蛋白，通過(guò)連接基團(tuán)將 pArg（ClpCNTD配體）與生物素（高親和力mSA配體）結(jié)合，形成 BacPROTAC-1 化合物。BacPROTAC-1 可結(jié)合 mSA 與 ClpCNTD，形成有活性的三元復(fù)合物，在100 μM劑量下可有效降解靶蛋白。
圖1 BacPROTAC-1 對(duì)枯草芽孢桿菌 ClpCP 的體外重編程
此外，已有研究報(bào)道 ClpC 在靜息狀態(tài)下是以一種 AAA 環(huán)被破壞的十聚體形式存在。當(dāng)銜接蛋白 MecA 與 ClpC 相互作用，會(huì)促進(jìn)功能性六聚體的重新組裝并激活 ClpCP 蛋白酶。然而尚不清楚大多數(shù)用 pArg 標(biāo)記的 ClpC 底物是如何觸發(fā) ClpC 十聚體的重塑。為了闡明這種基于 pArg 識(shí)別的激活機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)與 BacPROTAC-1 和 mSA-Kre 融合蛋白復(fù)合的 ClpC 進(jìn)行了冷凍電鏡結(jié)構(gòu)分析。
結(jié)果驚奇地發(fā)現(xiàn)，四個(gè) ClpC 六聚體通過(guò)它們的盤繞線圈 M 結(jié)構(gòu)域相互作用，排列成幾乎完美的四面體對(duì)稱。此外，為了以更高的分辨率解析激活的去折疊酶的功能單元，研究者還對(duì)單個(gè)六聚體進(jìn)行了聚焦的低溫冷凍電鏡分析，提供了 ClpC 在展開(kāi) BacPROTAC 束縛底物過(guò)程中的快照。ClpC 24-mer 的結(jié)構(gòu)表明 pArg 標(biāo)記不僅用作降解信號(hào)，而且還介導(dǎo)高階寡聚體的形成和 ClpC 的激活。開(kāi)發(fā)的含有 pArg 部分的 BacPROTAC 會(huì)觸發(fā)這種重塑機(jī)制，因此該雙功能小分子不僅可以作為化學(xué)接頭，而且可以作為 ClpCP 蛋白酶的激活劑。
然而，基于 pArg 設(shè)計(jì)的 BacPROTAC 藥代動(dòng)力學(xué)較差，磷酸胍基團(tuán)不穩(wěn)定。為了克服這些限制，研究團(tuán)隊(duì)尋找了一些可以替代 pArg 的 ClpCNTD 配體。其中，最具特征的 ClpCNTD 導(dǎo)向抗生素是 CymA，其結(jié)合位點(diǎn)在 ClpC1 去折疊酶中高度保守，但在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的 ClpC 蛋白中不存在，從而能夠選擇性地靶向分枝桿菌蛋白酶。此外，CymA 還可以通過(guò)分枝桿菌的細(xì)胞包膜。并且由于細(xì)胞生物素會(huì)競(jìng)爭(zhēng)與 mSA 結(jié)合并阻礙 BacPROTAC 活性，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步改造 BacPROTAC 的 POI 配體為 JQ1，其中 JQ1 是一種在 PROTAC 中應(yīng)用廣泛的 BRDTBD1 配體（BRDT 是一種沒(méi)有細(xì)菌同源物的人類蛋白質(zhì)，可以在不干擾內(nèi)源性途徑的情況下進(jìn)行選擇性的體內(nèi)降解）。該數(shù)據(jù)證實(shí) BacPROTAC 是一種多功能分子工具，可通過(guò)模塊化設(shè)計(jì)替換不同的靶蛋白配體與降解誘導(dǎo)模塊配體，應(yīng)用于不同的蛋白質(zhì)底物。
圖2：BacPROTACs 重新編程分枝桿菌 ClpCP
在進(jìn)行了充分的蛋白水平表征后，需要評(píng)價(jià) BacPROTAC 在細(xì)胞層面的活性。由于細(xì)菌中不表達(dá) BRDTBD1 蛋白，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)該蛋白的分枝桿菌。研究表明， BacPROTAC-3 以劑量依賴的方式降低細(xì)菌中 BRDTBD1 的水平；蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，僅 BRDTBD1 被顯著性降解，說(shuō)明該藥物具有良好的特異性。
圖3：BacPROTACs 介導(dǎo)分枝桿菌中靶蛋白選擇性降解
總的來(lái)說(shuō)，該研究開(kāi)發(fā)了一種新的雙功能小分子 BacPROTAC，將靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)擴(kuò)展到細(xì)菌。并且鑒于該雙功能小分子模塊化設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)， BacPROTAC 可以開(kāi)辟新的視野，開(kāi)發(fā)具有高選擇性和物種特異性的抗菌劑。此外，BacPROTAC 除了具有新型抗菌劑的潛力外，還可以用于了解細(xì)菌蛋白質(zhì)功能，從而發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)。但是值得一提的是，該研究仍存在靶蛋白體內(nèi)降解效率低下、BacPROTAC 低細(xì)胞滲透性等局限性，還需要進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)，并證明內(nèi)源性細(xì)菌蛋白可以以相同的方式降解。
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