淋巴細胞由于表面特異性抗原的差異可分為四大類（表10-3），這些不同抗原表現(xiàn)型的亞群執(zhí)行不同的機能。而且某些疾病會選擇性地損傷某些亞群而造成亞群之間的比例失調(diào)。根據(jù)FCM雙熒光分析的結(jié)果，現(xiàn)將不同的抗原和不同的機能的淋巴細胞亞群列于表10-4。

表10-13 主要淋巴細胞亞群的表面抗原

＋：表現(xiàn)的抗原；－：未表現(xiàn)的抗原；＋／－：主要亞群有表現(xiàn)的抗原；－／＋：抗原僅表現(xiàn)于少數(shù)亞群。

表10－14　淋巴細胞機能性亞群

外周血白細胞的機能，特別是淋巴細胞的機能狀態(tài)在一定程度上反應(yīng)了機體的免疫機能。近幾年來，用FCM來測定某些疾病的淋巴細胞及其亞群已成為重要的診斷和預(yù)后判斷的指標，如對骨髓、器官移植，免疫缺陷病的估價等。測定淋巴細胞亞群的主要依據(jù)是在于淋巴細胞表面不同的抗原表現(xiàn)型，而這些表現(xiàn)型又依賴于相應(yīng)的單克隆抗體而被識別。所以，特異性很高的單克隆抗體結(jié)合先進的FCM，已為臨床提供了不少非常有用而重要的資料，但被FCM所分析的淋巴細胞的整個臨床意義尚未完全認識清楚。隨著更多確定淋巴細胞表現(xiàn)型的試劑的應(yīng)用，F(xiàn)CM對診斷和治療計劃的擬定以及預(yù)后的估計將會表現(xiàn)出更重要的實用意義。

1．T淋巴細胞亞群的測定如前所述，在使用FCM分析時，先用0^。散射和90^。光散射雙指標將白細胞分為三群：淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。在二維點圖上劃出淋巴細胞群范圍后，設(shè)立GFL的RFL單指標的直方圖。命電子計算機僅計數(shù)所輸入的淋巴細胞，即劃線框出的那部分細胞。一般計數(shù)輸入的細胞可設(shè)1000～5000個。直方圖的分析可顯示陽性細胞的百分率。應(yīng)用輸入細胞數(shù)、陽性細胞百分數(shù)以及白細胞分類計數(shù)，就能得到陽性細胞的絕對值，即每立方毫米血液中的絕對值。有時T淋巴細胞某亞群的絕對值比百分率更為重要，因為它可以表明T細胞某亞群的增高和減少。當然，淋巴細胞占白細胞的百分數(shù)也是一個重要數(shù)據(jù)，應(yīng)當準確測出。

CD₄/CD₈細胞的比值，有時也用于反映病人淋巴系統(tǒng)的機能狀態(tài)。不少臨床免疫實驗室已把CD₄/CD₈的值作為常規(guī)血檢查的項目。在國際上，淋巴細胞亞群以及CD₄/CD₈并未建立統(tǒng)一數(shù)值，各實驗室均需建立自己的標準。平均值一般為1.73～2.00。

一般而言，影響淋巴細胞亞群的因素較多，如年齡、性別、種族、以及外周圍環(huán)境如季節(jié)　、藥品等的影響。T細胞的絕對值在兒童略高于成人。嬰兒CD₄細胞的百分率較成年人高；老年人的CD₈略低。正常人在一晝夜內(nèi)也有周期性的波動：上午CD₄略低，下午4時之后開始增加，直至次晨，平均波動為15%～20%。盡管正常情況下淋巴細胞亞群有所變動，但仍屬正常范圍。某些疾病，如器官移植、免疫疾病、免疫抑制和一些淋巴細胞腫瘤，其淋巴細胞亞群及其比值測量結(jié)果均可能偏離正常范圍。

有工作報道，傳統(tǒng)的T輔助誘導細胞（CD₄⁺）具有抑制機能，而在T抑制細胞毒細胞（CD₄⁺）中，有些又具有協(xié)助的功能。因此，對原來設(shè)想的CD₄、CD₈的機能分群有所混淆。預(yù)計會有新的單克隆抗體再從CD₄和CD₈的細胞中分出。不過就目前看來，不少臨床免疫實驗室已用CD₄/CD₈比值結(jié)合淋巴細胞絕對值對多種疾病的診斷、治療和預(yù)后的估計提供了不少有價值的資料。

2．艾滋病以及HLTV—III感染艾滋病是一種由人類T淋巴細胞病毒（HLTV--III）感染而造成的疾病。這種病毒主要侵襲CD₄⁺T細胞，而導致CD₄淋巴細胞減少，CD₄/CD₈淋巴細胞比值下降，甚至可低到0.5以下。艾滋病多發(fā)生在同性戀性行為活躍的男性，這可能與多次重復感染HLTV-III有關(guān)。對異性性行為活躍的人來講，對HLTV—IIi 感染的機會也不容忽視。另一種感染的途徑是HLTV血清陽性的獻血者對受血者的感染。有部分人血液中T淋巴細胞減少，CD₄/CD₈比值下降，但HTLV血清反應(yīng)不一定就是陽性。有些人CD₄減少不明顯，但CD₈有所增加，也會導致CD₄/CD₈的的比值下降。

對可疑為艾滋病及血清檢驗為陽性的人，T細胞亞群是分析了解免疫系統(tǒng)被病毒破壞程度的標志。初診時，CD₄細胞越少，CD₄/CD₈值越低者，預(yù)后越差。所以經(jīng)治療后恢復的指標則是CD₄細胞數(shù)增加，CD₄/CD₈比值升高。用熒光標記雙染色的FCM分析的結(jié)果表明，艾滋病人除CD₄和CD₈的改變外，同時還可以表現(xiàn)出OKT₁₀陽性細胞增多（圖10-15）。病人表現(xiàn)為CD₈和OKT₁₀同時增加時，預(yù)后比OKT₁₀陽性細胞低的病情嚴重。

圖10-15　健康人艾滋病人淋巴細胞表面抗原的比較

艾滋病人Leu₃⁺、Leu₈^-和Leu₃⁺、Leu₈⁺細胞均減少，而Leu₂⁺、Leu₈^-細胞相應(yīng)增加，

Leu₂⁺、Leu₇⁺與Leu2₃⁺、Leu₁₀⁺細胞明顯增加

3．白血病和淋巴瘤的表現(xiàn)型　近年來，為了弄清這些腫瘤的病理組織形態(tài)、影響治療效果的原因與免疫狀態(tài)的相互關(guān)系，對于不同類型的白血病和淋巴瘤作為廣泛的細胞表面表現(xiàn)型的研究。

在診斷方面，F(xiàn)CM與單克隆抗體結(jié)合，可以弄清這些腫瘤的免疫起源，特別是分清B細胞性、T細胞性或骨髓性腫瘤。同時，還可以證實一些與細胞起源相關(guān)的抗原，如普通

大部分淋巴系統(tǒng)腫瘤均起源于B細胞。而B細胞腫瘤常用抗免疫球蛋白的抗體來證實。由于前B細胞與漿細胞表面均無免疫蛋白，所以用檢測免疫球蛋白的辦法就只能證實B細胞發(fā)育中間時期的腫瘤。目前，已有一系列的B細胞表面抗原被發(fā)現(xiàn)，而可以證實B細胞個體發(fā)育的各個時期的腫瘤。

對B細胞腫瘤最有價值的抗原是CALLA。這種抗原僅存在于B細胞正常以育期的前B細胞、早期B細胞以及80%～90%的急性淋巴細胞性白血病。因此，抗CALLA抗體可以區(qū)別淋巴細胞性和髓性白血病。用抗CALLA結(jié)合其它一些成熟B細胞的單克隆抗體，如CD₁₉，CD₂₀，CD₂₄（B₄，B₁，BA_-1）將能證實大部分B細胞來源的腫瘤。圖10-16給出了B細胞分化的各個時期細胞膜的表現(xiàn)型。來源于B細胞的腫瘤和正常B細胞的表現(xiàn)型相似，也就是說，B細胞前身、成熟B細胞及最后分化為分泌B細胞—漿細胞。

圖10-16　B細胞分化各時期的細胞膜表現(xiàn)型

由于T淋巴細胞來源的腫瘤浸潤性較強，預(yù)后較差，并需要多種治療。T細胞腫瘤的表現(xiàn)型千變?nèi)f化，但大部分均表現(xiàn)T細胞抗原CD₇（Leu₉,3A）或其它T細胞抗原CD₂、CD₅（OKT₁₁，OKT₁）。這些抗原與腫瘤的細胞成熟時間有關(guān)，因而有助于擬定治療方案。從FCM分析的結(jié)果表明，非成熟的T細胞腫瘤常表現(xiàn)非成熟的T細胞抗原，如CD₁和t₁₀。而成熟的T 細胞腫瘤則僅表現(xiàn)成熟T細胞抗原：CD₂、CD₃、CD₅和CD₇。有時也可表現(xiàn)CD₂、CD₈，但不會出現(xiàn)在同一個細胞上面。

由于腫瘤細胞的多種來源，很難避免在腫瘤標本中混雜正常細胞，這給FCM的分析帶來技術(shù)上的困難。如殘留的紅細胞在FCM分析時，落入淋巴細胞框定的范圍內(nèi)而造成淋巴細胞各種亞群百分率下降。所以在制備標本時，應(yīng)盡量想法去除紅細胞。另一種污染是正常細胞存在于腫瘤細胞之間，這是一個很頭痛的問題。例如骨髓常被外周血污染，反應(yīng)性的正常淋巴細胞滲入到腫瘤組織中等，因此估計污染程度對解釋FCM分析的資料有一定的意義。因為在FCM分析時，正常細胞與腫瘤細胞可能由于不同的體積和密度而被分開，根據(jù)對污染的估計，仔細分析圖像就能得到比較正確的結(jié)果。

4．FCM對正常B細胞和B細胞腫瘤分析FCM對正常B細胞和B細胞腫瘤的分析在免疫學研究和臨床診斷上有著重要的實用價值，B細胞的某些特征必須使用FCM來分析，但是這在FCM技術(shù)方法中仍存在著一些需要解決的問題。

（1）B細胞的標記：B細胞膜表現(xiàn)免疫球蛋白（SIg）存在于所有成熟B細胞。最早的B細胞前身，細胞質(zhì)內(nèi)含有免疫球蛋白M（IgM），但不存在于細胞膜表面。細胞質(zhì)內(nèi)IgM的證實以及同時測定細胞表面的SIg，對FCM是很困難的，當然今后可能會用雙染法來解決這樣的難題。大部分成熟B細胞具有SIgM和SIgD，少量具有SIgG和SIgA，當然這也可能是因為不同的亞群的緣故。但僅以Ig的重鏈來分類B細胞是不可靠的，因為B細胞可以從膜表面的IgM逐漸轉(zhuǎn)變成IgG，因而從重鏈著手無法把B細胞分類。大部分B細胞腫瘤也表現(xiàn)出帶有SIgM和SigD。隨著B細胞逐漸轉(zhuǎn)變成漿細胞，膜表面Ig 逐漸喪失，在細胞質(zhì)內(nèi)又出現(xiàn)大量的免疫球蛋白。

與重鏈相反，B細胞的整個發(fā)生期只有一種k或者λ輕鏈，B細胞腫瘤克隆僅表現(xiàn)一種輕鏈，因此通過在FCM上顯示的不平衡的輕鏈表現(xiàn)可以確定B細胞腫瘤。測定方法見（3）。

用SIg的最大缺點是它的“嗜細胞性”，因為正常B細胞、自然殺傷細胞（NK）、激活T細胞以及所有巨噬細胞均有Fc段受體，因而可以不同程度地與抗SIg單克隆抗體的Fc段結(jié)合而產(chǎn)生非特異性的結(jié)果，因此選擇抗體時，應(yīng)使用已被胃蛋白酶消化過的、Fc段也被去除的、僅留下來的F（ab’）₂。

（2）FCM測定B細胞的臨床指證：

①免疫缺陷；免疫缺陷可以是先天性或獲得性的。低丙種球蛋白白血癥和無丙種球蛋白白血癥常伴有免疫球蛋白分泌的紊亂，因此有必要分析B細胞。

②淋巴瘤：非何杰金氏病的淋巴病，80%來源于B細胞。因而一旦懷疑為淋巴瘤，就應(yīng)仔細用FCM對B細胞的表現(xiàn)型進行分析，可以分析血、骨髓、以及活檢淋巴結(jié)等。首先確定腫瘤細胞的來源：B細胞性（CD₂₀⁺，SIg⁺）或T細胞性（CD₃⁺）。也有可能某些淋巴病來源于單核細胞（CD₁₁⁺）成裸細胞而表現(xiàn)出非T非B。一旦確立為B細胞來源后，就應(yīng)更進一步分析克隆增殖的性質(zhì)：單克隆、少克隆、或是多克降珠。單克隆性的增殖往往是腫瘤的標志。可以用SIg的輕鏈和重鏈分別加以測試，往往輕鏈比重鏈更有價值。在不久的將來，或許可以直接用免疫球蛋白的基本加以鑒別。

對B細胞亞群的確定，目前并未定論，但某些B細胞被CD₅（T₁，OKT₁）染色。正常B細胞中這些細胞較少，而多見于慢性淋巴性白血病和骨髓移植后的免疫缺陷時期。在B細胞的腫瘤病人中，10%的也可以出現(xiàn)CD₂₀（B₁）陰性反應(yīng)，這是B細胞成熟而將分化為漿細胞的標志。在異常B細胞上，往往有一些B細胞的標記缺失或其它表現(xiàn)型出現(xiàn)，因而對異常B細胞的FCM的分析尤為重要。圖10-17顯示CD₁₉—FITc （B細胞）和CD₅-PE（T細胞）雙染色的假三維圖像分析。X軸為綠色熒光的Leu₁₂(B細胞)，Y軸為紅色熒光的PE—Leu₁(T細胞)。從圖中可見，有較多的細胞表現(xiàn)出Leu₁₂⁺tLeu₁⁺,陰性區(qū)內(nèi)為NK細胞和紅細胞等。

圖10-17　異常B細胞雙染色的假三維圖

（3）k-λ測定B細胞克?。簁、λ測定法是一種從正常B細胞中測定少量B細胞克隆生長的方法。其基本原理是：若有B細胞克隆存在，將改變某一種輕鏈（k或λ）的熒光強度的分布。若輕鏈為k的B細胞生長，則抗k的抗體能測試出這種變化，而抗λ的抗體的測試沒有任何改變。正常情況下，B細胞的k和λ的熒光強度分布是一致的（見圖10-18）。

圖10-18　k-λ克隆的測定

正常情況，B細胞輕鏈分布圖像，一致κ和λ的波形沒有區(qū)別。但在異常時，若有單克隆生長，κ鏈有分布則與λ不一致，在總和的曲線形態(tài)上也會產(chǎn)生差異。

在實際應(yīng)用中，血液、體液、組織細胞的懸浮液效果均較好，而對于骨髓，大量細胞的非特異性標記會影響測定的結(jié)果。這里面必須強調(diào)，正常B細胞中的克隆細胞生長并不意味著它們必然是腫瘤細胞，還必須結(jié)合其它指標再做結(jié)論。不過這種方法對確定腫瘤細胞的存在、細胞發(fā)育階段、以及經(jīng)治療后病情控制的狀況等，都可以提供一些有用的資料。

以上僅限于從外周血的白細胞分析這一側(cè)面介紹了FCM的某些疾病中的臨床應(yīng)用。其實，它也僅只是問題的一個部分。例如，有研究工作表明：CD₃₄抗原在由紅系、巨核系、粒系和巨噬細胞三個細胞成株單元組成的成株細胞中有所表現(xiàn)。CD₃₄⁺細胞在人的骨髓細胞中約占1～4%，而在外周血中卻探測不到。又如，NK細胞近來被認為可能和人類的某些疾病的發(fā)病機理有關(guān)，對NK細胞的測量可以作為免疫治療的免疫監(jiān)測的重要參數(shù)和有效的預(yù)后征狀的指示。以前是用放射性的⁵¹Cr的釋放來檢測NK敏感的靶細胞的毒理學活性從而評估NK的功能的，而采用熒光探針CFDA（car－boxy—fluorescein diacetate）標記則可用FCM技術(shù)更為安全可靠地進行測定。有報告指出，健康男人的數(shù)值為（67.1±22.7%）%，健康女人為（63.9±20.0%）；患有婦科癌腫病人則為（38.5±23.1）%,明顯偏低。這些工作表明，F(xiàn)CM的技術(shù)從免疫組織化學角度還會有所發(fā)展。在第二節(jié)　我們曾簡單介紹了流式細胞分析技術(shù)在生物醫(yī)學工程中應(yīng)用的一些技術(shù)途徑，這也可以啟發(fā)我們借助于FCM來提高免疫組織化學的分析能力?？梢灶A(yù)見，F(xiàn)CM一定會成為免疫組織化學的一項重要的技術(shù)工具，并將在醫(yī)學科研和臨床應(yīng)用中發(fā)揮更大的作用。

附【美國Becton –Dickinson 公司可提供的FCM標準】熒光微球（Fluorescent beads）；雞紅細胞核（Chicken erythrocyte nu－clei）和小牛胸腺細胞核（Calf thymocyte nuclei），用于DNA測量的質(zhì)量控制；單克隆抗體試劑；以及用于免疫表型（immunopheno－typing）和其它臨床應(yīng)用的藥盒。