工程細菌或細菌衍生顆粒，它們包裹、分泌或表面展示治療分子，用于治療或預防各種疾病。

本文主要討論使用工程細菌：

? 作為微生物細胞工廠生產(chǎn)治療藥物

? 用于疾病特異性釋放治療劑的感覺和反應(yīng)系統(tǒng)

? 作為癌癥治療的靶向藥物輸送系統(tǒng)

? 使用細菌衍生顆粒作為先進藥物遞送載體

 1) 使用細菌作為靶向解剖位置的“輸送車”

 2) 細菌穩(wěn)定且持續(xù)地釋放天然或結(jié)合的療法

在一項研究中，一種腸道共生微生物Escherichia Coli Nissle 1917(EcN)被基因改造用于治療苯丙酮尿癥。

作為一種替代策略，研究人員改造的EcN表達苯丙氨酸代謝酶，以降低腸道中循環(huán)苯丙氨酸的水平。在苯丙酮尿癥的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)這種工程微生物顯著降低了苯丙酮尿癥小鼠的苯丙氨酸水平，以及在食用苯丙氨酸挑戰(zhàn)的食蟹猴身上。

攜帶代謝途徑或釋放苯丙氨酸裂解酶的工程菌

對苯丙氨酸水平的調(diào)控

Shen H, et al. Adv Drug Deliv Rev. 2022 

作為一種額外的安全特性，工程微生物的生長依賴于外源性二氨基庚二酸鹽，這在小鼠的腸道和環(huán)境樣本中沒有發(fā)現(xiàn)足夠水平的該物質(zhì)，從而確保了工程微生物的生物安全性。

另一項研究采取了另一種針對這種疾病的策略，通過改造羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri， L. reuteri)在腸道中持續(xù)分泌苯丙氨酸解氨酶來調(diào)節(jié) Phe。

還發(fā)現(xiàn)這種工程益生菌可以在給藥后3-4天內(nèi)降低苯丙酮尿癥小鼠模型中的循環(huán) Phe 水平。有趣的是，初步篩選顯示小鼠對分泌酶沒有免疫反應(yīng)，而在全身注射聚乙二醇化苯丙氨酸解氨酶后觀察到幾種免疫相關(guān)的不良反應(yīng)。

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CXCL12至皮膚，GLP-1至腸道，分別用于治療皮膚創(chuàng)傷和記憶學習；以炎癥性腸病為靶點的IL-10和IL-27的組成性產(chǎn)生。

各種研究還探索了使用口服疫苗（一種表達抗原的轉(zhuǎn)基因益生菌）來誘導免疫反應(yīng)，并保護免受特定細菌或病毒病原體的攻擊。

例如，工程化干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)組成性表達和分泌產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens, C.perfringens) α-毒素，以開發(fā)針對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的疫苗。在用工程益生菌治療的小鼠中，在腸粘液和糞便以及血清中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)氣莢膜素α-毒素。在腸道粘液和糞便以及血清中發(fā)現(xiàn)了能夠中和C.perfringens α-毒素的特異性IgG和IgA抗體。同樣，L. lactis經(jīng)過工程改造，可在益生菌表面表達HIV-1 Gag-p24，并能夠誘導抗HIV的IgA和IgG反應(yīng)。

益生菌也被用于治療皮膚。例如，研究人員設(shè)計的羅伊氏乳桿菌L. reuteri，使其產(chǎn)生趨化因子CXCL12，用在局部給藥時加速傷口愈合。CXCL12將巨噬細胞募集到傷口部位，促進組織修復。將生長因子直接運輸至傷口部位可能由于傷口的蛋白水解性質(zhì)而效果不佳。

研究發(fā)現(xiàn)，因乳酸天然產(chǎn)生，L. reuteri 給藥可降低傷口部位的pH值。這有助于延長CXCL12的生物利用度，因為由于pH降低，CD26對CXCL12的肽酶活性受到抑制。發(fā)現(xiàn)表達 CXCL12的工程化L. reuteri 在患有高血糖或外周缺血的小鼠身上，以及在人類皮膚傷口模型中，可以加速與慢性傷口相關(guān)的局部傷口的愈合。

此前，瑞典的Ilya Pharma公司使用這種經(jīng)過改造的益生菌完成了一項I期臨床試驗，并報告稱傷口愈合平均縮短了 3 天。第二階段試驗正在進行中。

腸道微生物群與神經(jīng)系統(tǒng)和心血管疾病發(fā)展之間日益密切的關(guān)聯(lián)為口服益生菌通過調(diào)節(jié)微生物群來靶向這些疾病提供了機會。

將感應(yīng)和反應(yīng)模塊整合到工程細菌中

以針對各種疾病采取針對性行動

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此外，由于效應(yīng)蛋白的持續(xù)表達造成的高代謝負擔會導致自發(fā)基因突變，從而降低細菌生長速度。在感覺和反應(yīng)系統(tǒng)的情況下沒有觀察到這一點，因為效應(yīng)器蛋白只在對感覺信號的反應(yīng)中產(chǎn)生。

例如，釀酒酵母通過感知和降解胞外三磷酸腺苷(eATP)來治療IBD。eATP是嘌呤能信號通路的一部分，參與IBD的生理過程。eATP能夠促進促炎細胞因子的產(chǎn)生和效應(yīng) T 細胞活化以及抑制調(diào)節(jié)性 T 細胞反應(yīng)。eATP被CD39水解為AMP，導致免疫抑制。

因此，在某項研究中，作者在酵母菌株中開發(fā)了一種高度敏感的P2Y2受體，通過進化天然的人類 P2Y2受體來檢測eATP。這種受體的激活與一種ATP降解酶的釋放有關(guān)。這種工程酵母菌株能夠抑制IBD小鼠模型中的腸道炎癥，類似于通常與各種不良反應(yīng)相關(guān)的標準護理療法。

使用活細菌開發(fā)抗癌遞送系統(tǒng)的不同策略

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腫瘤組織具有相同的代謝需求，但其氧氣供應(yīng)不足以支持其快速增長的腫塊。為了彌補這一點，腫瘤組織通過增強和不受控制的血管生成來加速其血管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展。結(jié)果，在實體瘤中形成了一個混沌的異質(zhì)血管網(wǎng)絡(luò)，形成了與血管系統(tǒng)的距離增加和耗氧量增多的微區(qū)域。

這種低氧微環(huán)境改變了腫瘤細胞的代謝并導致細胞靜止，從而導致腫瘤細胞產(chǎn)生治療耐藥性。此外，缺氧還調(diào)節(jié)和抑制腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫系統(tǒng)，從而保護腫瘤細胞免受免疫監(jiān)視。

已證明活細菌在本質(zhì)上定植于缺氧腫瘤區(qū)域。在荷瘤小鼠中，靜脈注射的細菌最初擴散到健康組織和腫瘤組織。隨著時間的推移，非腫瘤組織和循環(huán)中的細菌很快被清除；但由于缺乏免疫監(jiān)視，腫瘤中的細菌細胞茁壯成長。

據(jù)報道，兼性或?qū)Ｐ詤捬蹙?/strong>對腫瘤表現(xiàn)出更高的特異性，不會定植于非腫瘤性缺氧病變。因此在這些工程微生物系統(tǒng)中，通常選擇厭氧菌作為底盤。

以下討論用于癌癥治療的細菌細胞化學工程的策略以及簡要總結(jié)不同尋求腫瘤的細菌菌株的減毒方法。

一種是使用活細菌作為載體將細菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞中，這一過程稱為細菌轉(zhuǎn)染。在腫瘤治療中，細菌轉(zhuǎn)染可通過兩種方式應(yīng)用：

1) 將編碼治療性蛋白的cDNA導入腫瘤細胞，以主動誘導細胞死亡；

2) 將編碼腫瘤相關(guān)抗原的cDNA導入吞噬細胞抗原提呈細胞，以刺激對癌癥的免疫反應(yīng)。

在這兩種應(yīng)用中，載體細菌都被目標宿主細胞內(nèi)化，在目標宿主細胞中，細菌要么主動侵入癌細胞，要么被動地被免疫細胞獲取。在這方面，沙門氏菌屬和單核細胞增生李斯特菌最適合細菌轉(zhuǎn)染，并且已普遍用于癌癥治療。

在先前的研究中，一種帶有穿梭質(zhì)粒的工程化單核細胞增生李斯特菌菌株被用作小鼠前列腺癌模型中的DNA疫苗，在該模型中，單核細胞增生李斯特菌細胞主動地將腫瘤特異性抗原，前列腺特異性抗原(PSA)導入腫瘤細胞。工程改造的單核細胞增生李斯特菌成功地激發(fā)了導致腫瘤消退的T細胞特異性免疫反應(yīng)。

在另一項研究中也采用了類似的策略，在該研究中，單核細胞增生李斯特菌被改造成用于提供靶向黑色素瘤抗原基因-b(MAGE-b)的DNA疫苗，這導致了乳腺癌模型中的腫瘤消退。其他研究還使用鼠傷寒沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌菌株來傳遞編碼血管生成抑制劑蛋白（如內(nèi)皮抑素和內(nèi)皮糖蛋白）的基因，以抑制腫瘤進展。

與DNA類似，siRNA和shRNA的傳遞也需要細菌載體主動侵入靶癌細胞。到目前為止，細菌介導的 RNAi傳遞已在小鼠腫瘤模型中被應(yīng)用于多種基因的調(diào)節(jié)，包括IDO（免疫抑制劑吲哚胺 2,3-雙加氧酶）、PLK1（細胞周期相關(guān)蛋白，polo 樣激酶 1）、STAT3、survivin 和Sox2（性別決定區(qū)Y框蛋白2)。

除沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌外，有研究報道了一種可用于將shRNA導入癌細胞的侵襲性重組大腸桿菌BL21。該工程菌株表達來自單核細胞增生李斯特菌的侵襲素和李斯特菌溶血素O，使細菌能夠滲入癌細胞并從吞噬溶酶體中釋放針對連環(huán)蛋白B-1 (CTNNB1) 的shRNA。

連環(huán)蛋白B-1是一種已知的原癌基因，在一系列癌癥中發(fā)現(xiàn)突變或過度表達。

工程大腸桿菌菌株的施用導致結(jié)腸癌異種移植物和正常腸上皮細胞中的連環(huán)蛋白B-1蛋白水平顯著降低。當應(yīng)用于APC_min小鼠（一種腸道和乳腺腫瘤發(fā)生模型）時，工程大腸桿菌菌株導致腸息肉數(shù)量減少80%。

細胞毒劑的表達是使細菌具有高抗腫瘤活性的最直接的方法。為了減少對健康組織的可能損害，控制細胞毒素的表達，如大腸桿菌溶血蛋白溶細胞素A(ClyA)和金黃色葡萄球菌α-溶血素，以便在腫瘤特異性條件下進行誘導。

例如，有人改造了一種鼠傷寒沙門氏菌菌株，該菌株可以在缺氧環(huán)境中表達細胞毒性溶血素，并成功地抑制了小鼠乳腺腫瘤模型中的腫瘤生長。除了受控表達，細胞毒素也可以以癌癥靶向嵌合蛋白的形式傳遞。

據(jù)報道，一株表達具有EGFR（表皮生長因子受體）靶向配體的嵌合假單胞菌外毒素A的鼠傷寒沙門氏菌工程菌，該菌在體外對腫瘤細胞具有靶向殺傷作用。為了進一步驗證，研究人員將工程菌株應(yīng)用于患有結(jié)腸癌或乳腺癌的小鼠，并觀察到腫瘤生長顯著減少。

在免疫調(diào)節(jié)劑中，尋找腫瘤的細菌已經(jīng)被改造成表達各種細胞因子，包括IL-2、IL-1、IL-18和鞭毛蛋白等。應(yīng)用這些表達細胞因子的菌株已被證明可以調(diào)節(jié)對癌癥的免疫反應(yīng)，使腫瘤微環(huán)境 (TME) 對免疫治療敏感，并抑制腫瘤生長。

此外，已經(jīng)報道了兩項獨立的研究，其中工程化 EcN用于傳遞針對PD-L1和CTLA-4的檢查點阻斷納米抗體，以及針對免疫球蛋白CD47的納米抗體拮抗劑。這些納米體通過EcN的傳遞導致腫瘤浸潤性T細胞的激活增加，刺激腫瘤消退，并促進小鼠的長期生存。

除了直接影響腫瘤的有效載荷外，腫瘤靶向細菌也被設(shè)計用于表達和輸送前藥轉(zhuǎn)化酶。隨著這些細菌的定位，無害的前藥被系統(tǒng)地給藥，并被腫瘤中的細菌轉(zhuǎn)化為天然的細胞毒性形式，從而使天然藥物的脫靶活性最小化。

胞嘧啶脫氨酶(CD)是一種常用的前體藥物轉(zhuǎn)化酶，可將5-氟胞嘧啶(5-FC)（前體藥物）轉(zhuǎn)化為化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)（天然藥物）。

在一項初步的臨床試驗中，一種表達CD的鼠傷寒沙門氏菌菌株通過瘤內(nèi)注射和5-FC全身給藥應(yīng)用于三名難治性癌癥患者。在經(jīng)過六個治療周期后，沒有發(fā)現(xiàn)可歸因于工程菌株的重大不良事件。在三分之二的患者中，觀察到腫瘤內(nèi)細菌定植伴隨腫瘤中5-FU水平升高。

此外，有研究人員經(jīng)過工程化的 EcN 可以分泌重組黑芥子酶，將天然十字花科蔬菜中的硫代葡萄糖苷轉(zhuǎn)化為抗癌化合物蘿卜硫素。在小鼠結(jié)直腸癌模型中，聯(lián)合應(yīng)用工程化EcN和西蘭花提取物可顯著降低腫瘤發(fā)生率和腫瘤消退。

盡管腫瘤靶向活性很高，但毒力減弱對梭狀芽胞桿菌、李斯特菌和沙門氏菌屬的致病菌株至關(guān)重要，因為已知它們會引起感染。這可以通過刪除毒力基因或產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型突變來實現(xiàn)，使菌株無法自我分裂并引起感染。

例如，脂多糖 (LPS) 是革蘭氏陰性菌中產(chǎn)生的最有效的內(nèi)毒素之一，已知會引起系統(tǒng)性炎癥。在一株鼠傷寒沙門氏菌菌株中，編碼脂類A生物合成肉豆蔻酰轉(zhuǎn)移酶的msbB基因的缺失導致脂多糖產(chǎn)生的脂類A發(fā)生變化，從而減少了小鼠在細菌注射后產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α(TNF-a)的量。LPS修飾大大降低了細菌菌株的毒性，表現(xiàn)為小鼠的LD50（半數(shù)致死劑量）增加了10,000倍。

根據(jù)改進的LD50值，其他研究也報道了一種亮氨酸和精氨酸營養(yǎng)缺陷型沙門氏菌A1-R菌株，該菌株高度減毒，在各種模型中表現(xiàn)出高安全性。由于腫瘤中富含亮氨酸和精氨酸環(huán)境，該菌株也被證明優(yōu)先定植于腫瘤，并使腫瘤對化療敏感。

此外，常用的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009是一種攜帶msbB缺失的嘌呤營養(yǎng)缺陷型突變體，該底盤細菌已在各種小鼠模型中進行了廣泛研究，并已通過臨床試驗的安全性評估。

• 使用腫瘤特異性表達系統(tǒng)

另一種已采用的策略是使用腫瘤特異性表達系統(tǒng)，以確保細菌介導的治療傳遞的安全性。在這些系統(tǒng)中，有效載荷的表達受誘導型啟動子的調(diào)節(jié)，這些啟動子響應(yīng)于TME信號，包括缺氧和酸中毒或直接遞送至腫瘤部位的放射治療。

• 光熱療法

在其他情況下，研究人員還將材料科學和合成生物學結(jié)合起來，開發(fā)出細菌介導的光熱療法來治療癌癥。

在其中一些系統(tǒng)中，金納米顆粒(AuNPs)通過生物礦化涂覆在細菌表面。這些細菌經(jīng)過基因工程改造，可在對熱的反應(yīng)中表達抗腫瘤分子。在給藥細菌細胞并定位于腫瘤中后，部署近紅外(NIR)激光來殺死腫瘤細胞。在NIR照射下，AuNPs吸收透皮光子并將其轉(zhuǎn)化為局部熱量，這也激活了細菌中腫瘤抑制分子的表達，導致細胞死亡，同時產(chǎn)生的熱量。

已經(jīng)證明，在光誘導下，應(yīng)用含有AuNPs的生物礦化大腸桿菌細胞，在小鼠乳腺癌模型中表達TNF-α，在小鼠結(jié)腸癌模型中表達ClyA，從而導致顯著的腫瘤消退。

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這些顆粒比細菌細胞小，其中一些達到納米顆粒的大小，幾乎與納米晶體（<100 nm）相當。與相對均勻組裝的納米晶體和其他納米材料相比，細菌衍生的顆粒在它們的組成和劃分方面是不同的。此外，由于缺乏基因組DNA，這些顆粒無法復制，但仍保留了細菌細胞的部分結(jié)構(gòu)和功能。

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以下將簡要總結(jié)顆粒的性質(zhì)、它們的生產(chǎn)方法和它們的潛在應(yīng)用。

BGs是細菌的空細胞包膜，主要通過以下兩種方法產(chǎn)生：

1）在革蘭氏陰性菌中通過φX174噬菌體裂解蛋白E介導的溫和裂解，已經(jīng)證明，蛋白質(zhì)E在革蘭氏陰性菌中的重組表達導致細菌細胞裂解和BGs的產(chǎn)生；

2）革蘭氏陽性菌中通過化學還原方案產(chǎn)生，因為蛋白質(zhì)E在革蘭氏陽性菌中的表達導致細胞死亡而不裂解。

蛋白E是一種由91個氨基酸組成的多肽，可通過寡聚作用穿透細菌內(nèi)外膜的跨膜通道。在電子顯微鏡下，在蛋白E介導的大腸桿菌裂解過程中，觀察到直徑從40到200 nm不等的E裂解隧道。在高分辨率掃描電子顯微鏡中，在 E 裂解通道外觀察到排出云，表明細胞質(zhì)內(nèi)容物快速排出。

• 顆粒性質(zhì)

由于E裂解隧道融合了內(nèi)膜和外膜，從而封閉了細菌的周質(zhì)。使BGs具有以下性質(zhì)：

?? 不含細胞質(zhì)成分；

?? 保留了細胞形態(tài)和大多數(shù)表面結(jié)構(gòu)，包括外膜和內(nèi)膜，以及堅硬的肽聚糖層；

??保存了天然細菌的免疫原性元件，包括LPS、單磷酰脂A和鞭毛；

?? Toll樣受體（TLR）識別免疫原性元件，因此來自病原菌的BGs也能夠觸發(fā)先天免疫反應(yīng)。

• 潛在應(yīng)用

由于BGs不具有感染風險，其固有的佐劑特性使其成為通用的疫苗和佐劑候選物。

此外，在細菌中表達的重組膜蛋白也與完整的膜結(jié)構(gòu)一起保存在BGs中。通過外源抗原蛋白與膜錨定蛋白的重組融合，BGs可以被設(shè)計成在其外膜或內(nèi)膜上展示所選擇的抗原蛋白。通過這種方式，BGs可以作為載體將外來抗原運送給抗原呈遞細胞，并刺激針對特定病原體的免疫反應(yīng)。因此，這些重組BGs正在被評估為針對更廣泛范圍的傳染病的候選疫苗。

這些BGs保留了高活性的免疫原性元件，并對致病性天然菌株提供了顯著的保護作用。此外，來自這些細菌的BGs也正在被探索用于運送其他病原微生物的重組抗原。

• 生產(chǎn)方法

微細胞是在異常細胞分裂過程中產(chǎn)生的納米大小的細菌細胞(100到400nm)。在各種細菌中，操縱細胞分裂介質(zhì)或Min系統(tǒng)會導致產(chǎn)生微細胞。

例如，在大腸桿菌中，三種蛋白質(zhì)，即MinC，MinD和MinE，協(xié)同調(diào)節(jié)細胞分裂隔膜的正確定位，其中原核同源微管蛋白FtsZ形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Z環(huán))并啟動細胞分裂。在一些分裂細胞中，minCDE基因的缺失導致在非染色體的兩極出現(xiàn)錯位的Z-環(huán)，最終導致細胞分裂后形成微細胞。

• 顆粒性質(zhì)

• 潛在應(yīng)用

與BGs一樣，微細胞也被探索為候選疫苗和佐劑，因為它們在刺激宿主先天免疫方面具有很高的效率。微細胞優(yōu)于BGs，因為它們的尺寸更小，具有完整的膜細胞功能，并且在革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌中產(chǎn)生。除了存在于BGs和微細胞中的表面抗原外，后者還具有功能性的分泌系統(tǒng)。

除了候選疫苗，微細胞也被認為是納米顆粒，并已在各種研究中被評估為癌癥治療的藥物輸送容器。

• 生產(chǎn)方法

細菌膜囊泡 (BMVs) 是細菌衍生的基于脂質(zhì)的球形納米顆粒，甚至比微細胞 (20至400nm) 還要小。

根據(jù)囊泡膜的來源，BMVs可進一步分為：

? 外膜囊泡(OMVs)

? 爆炸性外膜囊泡(EOMVs)

? 外-內(nèi)膜囊泡(OIMVs)

? 細胞質(zhì)膜囊泡(CMVs)

源自革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的細菌膜囊泡

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典型的OMVs是在革蘭氏陰性細菌中通過外膜的氣泡形成的，并且富含周質(zhì)蛋白。

在噬菌體衍生的內(nèi)毒素存在下，肽聚糖層的降解將導致細菌細胞的爆炸性裂解，從而產(chǎn)生雙層OIMVs和EOMVs。

革蘭氏陽性細菌不具有外膜層，通過內(nèi)毒素介導的氣泡細胞死亡產(chǎn)生CMVs

• 顆粒性質(zhì)

在所研究的多種細菌物種中，發(fā)現(xiàn)OIMVs特異性包裹DNA，包括質(zhì)粒和染色體DNA，而EOMVs包含任意內(nèi)容。CMVs包含一系列細胞質(zhì)內(nèi)容物。

• 潛在應(yīng)用

鑒于脂質(zhì)體的藥物遞送系統(tǒng)的最新進展，LNPs和 BMVs作為替代藥物傳遞載體引起了極大的興趣。

也有通過電穿孔將治療性siRNAs裝載到OMVs中，并系統(tǒng)地將其注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，從而導致靶向基因沉默和顯著抑制腫瘤的生長。

除了癌癥，BMVs還被用于治療炎癥性疾病。源自腸道共生多形擬桿菌的OMVs被設(shè)計用于封裝和遞送重組人角質(zhì)形成細胞生長因子-2 (KGF-2)，用于治療小鼠模型中的結(jié)腸炎。OMVs的包封顯示在消化系統(tǒng)的傳代過程中穩(wěn)定了KGF-2