各位老師好，我是華中農(nóng)業(yè)大學植科院的博士后賀超，今天代表第三十組“麥客江湖”值日，本組的組長是河南省濮陽市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局的陳紅敏老師，組員有中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所的李淼淼老師，衛(wèi)輝市五星農(nóng)機有限公司的介百永老師，煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院的丁曉義老師、漯河市農(nóng)業(yè)科學院的廖平安老師、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院克山分院的李長輝老師、安徽省皖農(nóng)種業(yè)有限公司的黃建華老師和江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所的陳士強老師等。我目前的研究方向是利用調控組學技術解析機理，尋找并驗證小麥生長發(fā)育過程中的重要調控元件和調控事件，利用基因編輯創(chuàng)建新的遺傳變異，服務分子設計育種。我的資歷跟“一麥眾承”的各位老師相比實在太淺，僅抱著一顆學習的態(tài)度加入到這個溫馨的大家庭，深深地被老師們身上對科學研究的熱情以及育種事業(yè)的熱忱感染，今天也鼓起勇氣跟各位老師就小麥向導RNA（guide RNA，gRNA）的設計進行交流，不足之處懇請指正。

基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因編輯技術打破了傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)育種性狀改良的瓶頸，其在作物品種改良中具有廣闊的應用前景。CRISPR/Cas的靶向編輯功能依賴于gRNA的向導，通過設計與靶向序列互補的gRNA，可實現(xiàn)靶位點的定點突變或將特定功能的蛋白帶到靶位點上，創(chuàng)造新的種質資源。然而，當gRNA的特異性不強時，極易產(chǎn)生脫靶現(xiàn)象，嚴重限制了CRISPR/Cas的定點操控功能。小麥是異源六倍體作物，其基因組異常龐大且重復序列占比高，這大大加劇了特異高效gRNA設計的難度。因此，選擇一款適用于小麥gRNA的設計工具非常重要。目前支持小麥基因組gRNA設計的工具，包括WheatCrispr、E-CRISP、CRISPRdirect和CRISPR-Cereal等，本文將著重比較這幾款gRNA設計工具的優(yōu)缺點，以供科研工作者參考。

1 WheatCrispr網(wǎng)站優(yōu)缺點

1.1 WheatCrispr簡介

WheatCrispr（https://crispr.bioinfo./WheatCrispr/）是專為小麥基因組基因gRNA設計而開發(fā)的生信工具[1]（圖1），其使用的參考基因組為六倍體“中國春”基因組組裝版本IWGSC v1.0，針對的基因編輯系統(tǒng)僅為CRISPR/SpCas9，識別的PAM序列分為Canonical（5?-NGG-3?）和Non-canonical（5?-(NAG, NCG, NGA-3?）2類，設計的gRNA其互補序列既可位于外顯子上又可分布于啟動子區(qū)域。

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           圖1 WheatCrispr的gRNA設計結果

對于編輯效率的評估和off-target頻率的預測，WheatCrispr使用的是Doench算法；為了減少工作量，在基因組搜索可能的脫靶序列時，其策略是針對不同PAM序列及其所在的不同區(qū)域（啟動子/UTR/外顯子/內含子/基因間區(qū)）分別使用不同的最大容許錯配數(shù)進行序列比對。WheatCrispr網(wǎng)站的使用是先提交基因名稱或序列，隨后后臺從提前構建好的gRNA數(shù)據(jù)庫中匹配相應的gRNAs，最后將匹配到的gRNAs及其相關信息反饋到結果頁面。gRNA數(shù)據(jù)庫的構建流程可總結為：i.全基因組范圍內搜索PAM位點，將PAM序列及與其上游20個堿基互補的gRNA序列提取出來；ii.先根據(jù)PAM序列將與其對應的gRNA分為canonical和non-canonical兩類，再根據(jù)gRNA序列所在的位置將gRNA進一步按外顯子、啟動子、其他基因功能區(qū)域（內含子和UTR）以及基因間區(qū)進行分類，即最后gRNA共分為8類；iii.將位于基因外顯子和啟動子上的canonical gRNA序列單獨調取，作為on-target gRNA數(shù)據(jù)庫，并利用rs2算法計算該數(shù)據(jù)庫中每一條gRNA的on-target效率；iv.將on-target gRNA數(shù)據(jù)庫中的每條gRNA序列分別用相應指定的最大容許錯配數(shù)與8類gRNAs分別比對，同時用Doench CFD算法預測off-target頻率。

1.2 WheatCrispr優(yōu)點

1）可針對啟動子區(qū)域設計gRNA序列，因此可為轉錄調控的CRISPR/Cas系統(tǒng)設計gRNA；

2）先構建gRNA數(shù)據(jù)庫，再根據(jù)用戶提交的序列去gRNA數(shù)據(jù)庫中調取匹配到的序列，節(jié)約了用戶等待的時間和后臺運行的工作量；

1.3 WheatCrispr缺點

1）參考基因組僅使用“中國春”基因組組裝版本IWGSC v1.0，而常規(guī)研究用到的材料眾多，且不同材料具有豐富的遺傳變異，因此當使用非中國春的材料時，設計出來的gRNA其靶向的區(qū)域可能存在SNP位點，大大降低了編輯的效率。

2）僅可為CRISPT/SpCas9系統(tǒng)設計gRNA序列，限制了用戶的選擇。

3）將gRNA根據(jù)其所在染色體上的位置進行分類，雖然節(jié)約了工作量，但過于武斷，因為基因不同區(qū)域的分類是基于IWGSC v1.0注釋文件，其中基因啟動子區(qū)域定義為基因上游2 kb區(qū)域，而這會導致X基因的promoter區(qū)域可能是Y基因外顯子或其他基因結構的部分區(qū)域，從而造成8種不同類型gRNA子數(shù)據(jù)庫序列存在重復。

4）顯示的gRNA信息單一，無法為后續(xù)驗證工作提供必要的信息。

5）網(wǎng)站缺少一個“submit”按鈕，只要輸入一個基因的ID或序列，甚至更改任一選項，都會自動開始加載結果，而不是等用戶做好了所有選擇再加載結果，這樣既浪費了用戶的時間，也增加了后臺運行工作量。

2 E-CRISP網(wǎng)站優(yōu)缺點

2.1 E-CRISP簡介

E-CRISP（http://www./E-CRISP/）網(wǎng)站支持包含小麥在內的55個物種CRISPR-Cas系統(tǒng)gRNA的設計[2]（圖2）。小麥的參考基因組使用“中國春”基因組組裝版本IWGSC v1.0，同時利用高密度遺傳圖譜popseq.31進行序列校正；識別的PAM序列為NRG (R=G或A)，即gRNA的設計僅針對CRISPR/Cas9系統(tǒng)。E-CRISP利用Bowtie/Bowtie2在基因組范圍內匹配gRNA和預測off-target位點，同時以gRNA匹配的程度以及找到的off-target位點數(shù)量來評價gRNA。利用E-CRISP設計gRNAs時，需先選擇所針對的物種和設計的目的，隨后提交基因ID（僅支持Ensembl ID）或序列（fasta格式），還可提前設定gRNA互補序列所處的位置范圍，最后將這些預設信息一并提交即獲得設計結果。

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               圖2 E-CRISP的信息提交界面

2.2 E-CRISP優(yōu)點

以下優(yōu)點均針對小麥基因組CRISPR-Cas系統(tǒng)的設計。

1）適用于基因敲除、轉錄沉默和激活的CRISPR/Cas系統(tǒng)gRNA的設計；

2）設計時可指定互補序列所處的位置，還可規(guī)避CpG島；

3）可批量為多個基因設計gRNA，同時支持本地命令行操作；

4）結果可選擇顯示TSS、起始密碼子、終止密碼子和限制性內切酶酶切位點的位置信息，也可將這些結果導出為gff格式文件，可輔助gRNA的選擇；

5）Off-target數(shù)據(jù)庫分為3個子數(shù)據(jù)庫，分別為染色體DNA數(shù)據(jù)庫、包含內含子的基因數(shù)據(jù)庫以及mRNA數(shù)據(jù)庫，用戶可根據(jù)實際需要進行選擇，這在滿足了用戶需求的同時減少了后臺數(shù)據(jù)分析的工作量。

2.3 E-CRISP缺點

1）參考基因組只使用“中國春”基因組IWGSC v1.0，識別的PAM序列僅針對Cas9，缺點同WheatCrispr；

2）用Bowtie/Bowtie2進行序列比對時，其容許的最大錯配數(shù)為2，因此采用這一方法預測off-target位點時只能匹配到與gRNA序列僅具有2個或2個以下堿基差異的位點，而忽略了其他可能大量真實存在的情況；

3）僅以序列匹配程度來衡量gRNA的效率、以找到的off-target位點數(shù)量來衡量off-target頻率，這種方法不合理之處一方面在于并不是100%匹配的gRNA其效率就越高，因為同時存在參考基因組序列與目的品種在該序列上存在SNP的問題，另一方面，并不是所找到的off-target位點越少對應的gRNA編輯效率就越高，因為off-target僅僅是預測的結果，且比對使用的最大錯配數(shù)被限制為2個，這大大減少了off-target的數(shù)量，使用這一策略預測到的off-target位點數(shù)量遠遠低于某條gRNA全部可能的off-target數(shù)量；

4）gRNAs互補序列位點和off-target位點分開顯示，沒有將每條gRNA對應可能產(chǎn)生的off-target位點的位置和序列與該條gRNA的信息對應顯示，這不便于用戶對所匹配到的gRNA進行選擇。

3 CRISPRdirect網(wǎng)站優(yōu)缺點

3.1 CRISPRdirect簡介

CRISPRdirect網(wǎng)站“Species”的選項多達633個，小麥僅是其中之一的物種，且也只包含“中國春”這一個小麥品種[3]（圖3）。CRISPRdirect中小麥的參考基因組和識別的PAM序列同E-CRISP，不同之處在于CRISPRdirect設計頁面非常簡單，用戶只需要提交目的序列并選擇相應的基因組即可快速獲得結果，并沒有其他參數(shù)可作調整。CRISPRdirect預測off-target分為3種模式，分別為20mer PAM、12mer PAM和8mer PAM，分別表示在全基因組范圍內匹配靶點和預測off-target的位點時必須完全匹配的堿基數(shù)以及與PAM前12或8個堿基（“seed”）完全匹配的堿基數(shù)，比對使用的工具為GGGenome。

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圖3 CRISPRdirect的gRNA設計結果

3.2 CRISPRdirect優(yōu)點

1）可提交最長為10 kb的序列進行比對；

2）利用GGGenome軟件在基因組范圍內匹配靶點和off-target位點，基于GGGenome快速、高效的優(yōu)點，使獲得的結果更為準確，且GGGenome支持匹配的序列存在個別堿基的插入和缺失；

3）利用“seed”序列的必要性來預測可能的脫靶效應，提高了預測結果的準確性；

4）傻瓜式操作，獲取結果簡單快速；

5）顯示了匹配到的gRNA在染色體上的方向，便于后續(xù)分析；

6）高亮顯示off-target位點少的gRNAs，便于用戶快速選擇；

7）結果提供了gRNA互補序列的GC含量、Tm值、TTTT位點和限制性酶切位點信息，可輔助用戶進行gRNA的選擇。

3.3 CRISPRdirect缺點

1）參考基因組只使用“中國春”基因組組裝版本IWGSC v1.0，僅支持CRISPR/SpCas9系統(tǒng)gRNA的設計；

2）尋找靶點時不允許錯配，忽略了不同品種小麥間的SNP，可能丟失真正的靶點；

2）預測off-target位點時只考慮PAM之前的“seed”片段的匹配程度，而不限制“seed”片段之前的序列其可容許的缺失、插入和錯配數(shù)，這會導致匹配的off-target數(shù)量比預期多；

3）沒有顯示gRNA互補序列所在的基因結構區(qū)域，不能對靶點所處位置的合理性作出快速判斷；

4） 僅可在外顯子區(qū)域設計gRNA，無法為以轉錄調控為目的的CRISPR/Cas系統(tǒng)設計gRNA。

4 CRISPR-Cereal工具優(yōu)缺點

4.1 CRISPR-Cereal簡介

CRISPR/Cas系統(tǒng)的編輯效率不僅依賴guide RNA (gRNA) 的序列特征，還受靶向區(qū)域染色質狀態(tài)的影響，另外，靶向基因的本底表達水平以及核苷酸多態(tài)性位點的存在與否也會影響CRISPR/Cas的效率。CRISPR-Cereal是一款整合了靶向區(qū)域的調控信息和基因組變異信息的gRNA設計工具[4]（圖4），其使用的小麥參考基因組組裝版本為IWGSC v1.0，注釋版本為IWGSC v2.1，識別的PAM序列包括NGG和TTTN，即可同時支持CRIPSR/Cas9和CRIPSR/Cpf1系統(tǒng)。CRISPR-Cereal利用Flashfry算法實現(xiàn)gRNA的on-target和off-target位點的預測，使用的打分算法為Doench CFD。

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   圖4 CRISPR-Cereal設計高效特異gRNA的特點

3.2 CRISPR-Cereal優(yōu)點

1）支持提交基因名稱、序列和位置信息，即可針對基因又可針對非編碼序列設計gRNA；

2）可快速在全基因組范圍內搜索脫靶位點，最大錯配數(shù)為5；

3）對每個脫靶位點進行了注釋，如果脫靶位點中包含靶位點的同源基因，選擇該條gRNA，可同時實現(xiàn)小麥多個同源基因的編輯；

3）展示了靶基因的表達量和染色質開放性以及組蛋白修飾信息，直觀地體現(xiàn)了gRNA是否位于染色質開放性區(qū)域以及是否包含組蛋白修飾位點，輔助gRNA的選擇；

4）展示了靶位點的SNP信息，有利于非參考基因組材料的gRNA選擇；

5）可下載靶位點和脫靶位點的全部信息，方便gRNA的篩選。

3.3 CRISPR-Cereal缺點

1）由于目前小麥的染色質開放性數(shù)據(jù)和組蛋白修飾數(shù)據(jù)較少，難以開發(fā)一套針對染色質狀態(tài)的打分算法來綜合評價gRNA的編輯效率，CRIPSR-Cereal僅僅通過有跟無的定性來對靶基因的染色質狀態(tài)進行打分和評價，無法讓用戶不通過篩選和比較即可獲得最推薦的gRNA序列；

2）現(xiàn)僅支持IWGSC v1.0版本的參考基因組，如果要針對以IWGSC v2.0為參考的序列設計gRNA，只能通過提交序列的方式進行設計，后續(xù)還需將gRNA序列與IWGSC v2.0參考序列進行比對，才可獲得靶向位點的具體位置信息。

參考文獻

[1] Cram D, Kulkarni M, Buchwaldt M, et al. WheatCRISPR: a web-based guide RNA design tool for CRISPR/Cas9-mediated genome editing in wheat. BMC Plant Biol, 2019,19(1):474.

[2] Heigwer F, Kerr G, Boutros M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods, 2014,11(2):122-123.

[3] Naito Y, Hino K, Bono H, et al. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics, 2015,31(7):1120-1123.

[4] He C, Liu H, Chen D, et al. CRISPR-Cereal: a guide RNA design tool integrating regulome and genomic variation for wheat, maize and rice. Plant Biotechnol J, 2021,19(11):2141-2143.