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盡管免疫學(xué)技術(shù)已取得很大的進(jìn)展，但令人吃驚的是在人類疫苗中還主要依賴鋁為基礎(chǔ)的復(fù)合物作為主要的佐劑。疫苗佐劑(Adjuvant)是能夠非特異性地改變或增強(qiáng)機(jī)體對抗原的特異性免疫應(yīng)答、發(fā)揮輔助作用的一類物質(zhì)。隨著疫苗產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，除了傳統(tǒng)的鋁佐劑和最新在流感疫苗獲批的MF59佐劑之外，越來越多的新佐劑受到關(guān)注。但其作用機(jī)制和安全、有效性評價較為復(fù)雜，對監(jiān)管者、佐劑研發(fā)者和使用者均提出一系列挑戰(zhàn)。小編結(jié)合自己的專業(yè)理解，在網(wǎng)上找到兩個相關(guān)的技術(shù)指導(dǎo)原則和一本書籍，分享如下。

WHO：Guideline for Nonclinical Evaluation of Adjuvant Vaccines

1

該指導(dǎo)原則的適用范圍

該指導(dǎo)原則主要適用于為傳染性疾病防治而研發(fā)的佐劑疫苗，包括預(yù)防性疫苗和治療性疫苗，但不包括治療非傳染性疾?。ㄈ绨┌Y和過敏）的治療性疫苗。與會專家一致同意：由于抗原、佐劑和抗原/佐劑制劑的復(fù)雜性，佐劑本身不會得到授權(quán)，其必須作為某種含佐劑疫苗的組分去申請授權(quán)，而且每一種新的含佐劑疫苗都應(yīng)當(dāng)視為一種新的獨(dú)立制品，需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)睦砘匦浴⒎桥R床和臨床評價才可獲批。但從相似產(chǎn)品獲得的已有數(shù)據(jù)可為非臨床和臨床研究提供重要指導(dǎo)信息。

2

候選佐劑和含佐劑疫苗所需的生產(chǎn)和質(zhì)控信息

為了確保抗原和佐劑具有合適的質(zhì)量，生產(chǎn)控制（如質(zhì)量、含量、純度及效力等）及其控制范圍在研究階段和商業(yè)化生產(chǎn)階段、以及不同臨床實驗階段均不盡相同。在早期臨床實驗中，應(yīng)開發(fā)合適的分析方法并予標(biāo)準(zhǔn)化。通常包括鑒定和定量檢測一種復(fù)雜的含佐劑疫苗中的各種組分（包括抗原、佐劑、其他重要組分以及疫苗中的添加劑）、評價與佐劑活性相關(guān)的特性（如外觀、顆粒大小和顆粒大小分布、聚集物的存在、抗原吸附的完全性以及pH）、評價抗原/佐劑兼容性和含佐劑疫苗各組分間物理相互作用等。當(dāng)然，評價疫苗成品效力的QC實驗也是必須的，但效力試驗可反映也可不反映佐劑對于含佐劑疫苗效力的貢獻(xiàn)大小，如果效力實驗不反映佐劑的貢獻(xiàn)，評價疫苗成品中或單獨(dú)包裝的佐劑中佐劑的含量就很重要。應(yīng)該注意的是，在非臨床研究中所使用的抗原、佐劑和含佐劑疫苗的批次在生產(chǎn)、理化性質(zhì)、效力和穩(wěn)定性方面應(yīng)與臨床用苗相當(dāng)并具有很好的代表性。在后期臨床研究中，生產(chǎn)者應(yīng)特別關(guān)注成品生產(chǎn)過程有無任何微小的變化，并評價這些變化能否影響產(chǎn)品安全性。隨著臨床研究和產(chǎn)品研發(fā)的進(jìn)行，生產(chǎn)者應(yīng)當(dāng)提供對關(guān)鍵步驟、中間產(chǎn)品以及初期接受標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制的信息，以確保生產(chǎn)過程在各關(guān)鍵點(diǎn)可控。生產(chǎn)者應(yīng)提供充分證據(jù)確保臨床研究將產(chǎn)生可靠的可解讀的數(shù)據(jù)。

3

非臨床評價應(yīng)選擇相關(guān)實驗動物模型的考慮點(diǎn)

對影響佐劑和含佐劑疫苗的安全性和免疫原性研究，應(yīng)選擇合適的動物模型。選擇時通常應(yīng)考慮如下幾點(diǎn)：

1）給藥途徑：毒理學(xué)評價所用的給藥方式應(yīng)當(dāng)與臨床實驗一致，如臨床試驗使用特殊器械進(jìn)行給藥，動物實驗也盡可能使用相同器械；

2）基線免疫狀態(tài)：應(yīng)明確界定與安全性評價最相關(guān)的基線免疫狀態(tài)；

3）理想的動物模型應(yīng)能重復(fù)出人體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)；

4）能夠得到的歷史性數(shù)據(jù)。在大多數(shù)情況下，對于新的佐劑和含佐劑疫苗，一種相關(guān)動物模型就足夠了。

但何為相關(guān)模型，是個十分復(fù)雜的問題。理想狀態(tài)下，選擇的動物應(yīng)當(dāng)對疫苗所抵抗的細(xì)菌、病毒或寄生蟲抗原具有易感性。關(guān)于靈長類動物的選擇，專家認(rèn)為，當(dāng)有其他種類動物可供使用時，沒有必要使用非人靈長類動物。另外應(yīng)該注意，由于動物對抗原或佐劑的反應(yīng)特異性，使用動物模型預(yù)測人類免疫反應(yīng)具有局限性，而且動物研究可能無法檢測到那些罕見的副反應(yīng)。

4

佐劑評價的主要內(nèi)容點(diǎn)

1）評價體液免疫反應(yīng)的強(qiáng)度（如抗體平均滴度或濃度）、質(zhì)量（抗體親和力）以及活性作用（即中和活性）；

2）評價細(xì)胞免疫，包括對某種特異的細(xì)胞免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的評價，如Th1和Th2型反應(yīng)、可檢測細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的誘導(dǎo)等；

3）評價合適動物模型中的保護(hù)作用；

4）闡明佐劑作用模式和免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)理。

上述研究結(jié)果將有助于解讀非臨床安全性研究，并確定將來臨床研究中將被檢測的潛在副反應(yīng)。體外功能性實驗可為了解佐劑的作用模式提供幫助，可提供有價值的補(bǔ)充性數(shù)據(jù)，如通過檢測抗原遞呈細(xì)胞表面受體表達(dá)量的改變以及細(xì)胞因子的分泌，可對佐劑的作用效果進(jìn)行評價。

5

藥物非臨床安全性評價動物實驗

安全性評價動物實驗對于確定合適的佐劑/抗原比例和安全劑量、免疫方法和給藥途徑，以及確定臨床試驗初期需檢測的未知或潛在不良反應(yīng)非常重要。由于抗原、佐劑和佐劑疫苗的最終制劑均有可能導(dǎo)致安全問題，佐劑疫苗的安全性評價應(yīng)包括單獨(dú)佐劑的毒性研究和佐劑疫苗的毒性作用。

1）單獨(dú)佐劑的毒性研究；

2）佐劑疫苗最終制劑的毒性研究；

佐劑疫苗最終制劑的非臨床毒性研究用于評價疫苗的局部反應(yīng)原性和全身毒性，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)和確定疫苗潛在的不良反應(yīng)，以推斷疫苗安全性是否達(dá)到臨床試驗要求。其中，重復(fù)劑量毒性研究最為重要，通常應(yīng)在一種適當(dāng)物種（主要是敏感物種）中進(jìn)行，必要時，可按照不同產(chǎn)品選擇額外物種進(jìn)行試驗。佐劑疫苗最終制劑的重復(fù)劑量毒性研究應(yīng)全面考慮，周密設(shè)計。

6

臨床評價早期考慮因素

除了與一般疫苗類似的早期臨床試驗考慮因素外，新型佐劑疫苗臨床評價尚有其獨(dú)特的問題需要考慮。

1）盡管一個佐劑疫苗的早期臨床試驗并不需要陰性對照組，但這類接種了無活性鹽安慰劑的對照組有助于初始安全數(shù)據(jù)的解釋。但從倫理角度，應(yīng)盡量避免單獨(dú)佐劑對照組，而首選安慰劑和單獨(dú)抗原制劑組。2）制造商應(yīng)該提供疫苗中使用佐劑的理由，包括有關(guān)添加佐劑好處的臨床前研究信息（如概念驗證研究、攻擊模型數(shù)據(jù)）、有/無佐劑疫苗的早期臨床安全性和免疫原性研究數(shù)據(jù)及其增強(qiáng)免疫反應(yīng)和節(jié)約抗原的數(shù)據(jù)等。

3）由于佐劑本身可能誘發(fā)極強(qiáng)的固有免疫反應(yīng)，以及佐劑對抗原的增強(qiáng)免疫反應(yīng)均可導(dǎo)致不良事件，評價時應(yīng)予充分關(guān)注。

4）由于新型佐劑可能誘導(dǎo)自體免疫或自身炎癥疾病，建議在新型佐劑的臨床試驗中，對所有治療組受試者遲發(fā)性自身免疫疾病相關(guān)的嚴(yán)重不良事件進(jìn)行監(jiān)測，檢測時間建議擴(kuò)展到疫苗接種后12個月，但臨床研究報告的提交和后繼臨床研究的啟動不需因隨訪而推遲。。

歐盟：Guideline on adjuvants in vaccines

該指導(dǎo)原則詳細(xì)介紹了歐洲藥品審評署(EMEA)關(guān)于人用疫苗佐劑的指導(dǎo)原則。該指導(dǎo)原則闡明了佐劑的定義、分類及其作用機(jī)制,并對佐劑的質(zhì)量研究、非臨床研究和臨床研究提出了具體要求，目錄如下：

CONTENTS

1. INTRODUCTION

2. SCOPE

2.1. Vaccines

2.2. Adjuvants

3. QUALITY

3.1. The adjuvant

3.1.1. Deion

3.1.2. Manufacture

3.1.3. Characterisation

3.1.4. Routine testing

3.1.5. Stability

3.2. Adjuvant/antigen combination

3.2.1. Development and manufacture of the combination

3.2.2. Characterisation

3.2.3. Routine testing

3.2.4. Stability

3.2.5. Multiple antigen/adjuvant combinations

3.3. Final product

4. NON-CLINICAL

4.1. Proof of Concept

4.2. Pharmacokinetics

4.3. Toxicity of adjuvant alone

4.3.1. Local tolerance

4.3.2. Induction of hypersensitivity and anaphylaxis

4.3.3. Pyrogenicity

4.3.4. Systemic toxicity

4.3.5. Reproduction toxicity

4.3.6. Genotoxicity

4.3.7. Carcinogenicity

4.3.8. Combination of adjuvants

4.4. Toxicity of adjuvant in combination with the proposed antigen

4.4.1. Local tolerance

4.4.2. Repeated dose toxicity studies

4.4.3. Characterization of the immune response

5. CLINICAL

5.1. Introduction

5.2. Preliminary studies

5.2.1. Effect of the adjuvant on the immunological response

5.2.2. Dose-finding studies

5.3. Confirmatory trials

5.3.1. General considerations

5.3.2. Possible scenarios

5.3.2.1. New vaccines with a new or established adjuvant

5.3.2.2. Changes to the adjuvant content of a licensed vaccine

5.3.3. Statistical considerations

佐劑書籍：Vaccine Adjuvants：Methods and Protocols

Edited by Gwyn Davies

St. George’s University of London, London, UK

書籍：疫苗佐劑的研究與質(zhì)量控制

第五節(jié)：佐劑的安全性評價

一、佐劑的非臨床研究

佐劑的臨床研究除了關(guān)注其免疫增強(qiáng)作用外，還應(yīng)十分關(guān)注其不良反應(yīng)，應(yīng)從以下幾個方面進(jìn)行考慮：

（一）佐劑對抗原免疫原性的作用

佐劑對抗原免疫原型是佐劑應(yīng)用的基礎(chǔ)，必須有充分的動物模型證據(jù)表明佐劑的使用真正能夠誘發(fā)和加強(qiáng)機(jī)體產(chǎn)生長期、高效的特異性免疫反應(yīng)，從而提高機(jī)體的保護(hù)力。免疫效果應(yīng)包括體液免疫和細(xì)胞免疫兩個方面、觀察機(jī)體抗體的產(chǎn)生情況和持續(xù)時間。理想情況下，應(yīng)該使用相關(guān)的動物模型證明其對病原物生物致死性攻擊的防御效果，如果不存在這樣的模型，應(yīng)選擇能誘導(dǎo)產(chǎn)生與人體免疫應(yīng)答特性相似的動物模型。

（二）藥代動力學(xué)

新的佐劑在與抗原進(jìn)行混合使用以前應(yīng)單獨(dú)給藥進(jìn)行人體藥代動力學(xué)研究，以取得科學(xué)的、令人信服的結(jié)果。佐劑與疫苗混合后，除了進(jìn)行理化分析觀察其結(jié)合、解離、相互作用的情況外，還應(yīng)進(jìn)行臨床分析取得更直觀的科學(xué)數(shù)據(jù)，以對佐劑效果做進(jìn)一步分析。

（三）佐劑及佐劑/抗原結(jié)合物的毒性

應(yīng)對佐劑及佐劑/抗原結(jié)合物分別進(jìn)行試驗，以檢查佐劑及佐劑/抗原結(jié)合物的毒性。在臨床前安全評價中多使用小鼠作為動物模型，但不同動物品系的小鼠，甚至一個種內(nèi)的不同株，對同一佐劑都可能顯示不同反應(yīng)。建議使用至少兩種以上小鼠（最好使用已經(jīng)進(jìn)行過佐劑活性研究的動物），載輔以家兔或豚鼠進(jìn)行動物實驗。疫苗和佐劑單獨(dú)使用或二者混合使用時，其濃度應(yīng)模擬或大于人體使用劑量。佐劑及佐劑/抗原結(jié)合物的毒理學(xué)分析主要考慮接種部位的病理反應(yīng)、局部耐受性、致超敏作用、過敏反應(yīng)、對組織和器官的全身毒性、免疫抑制作用、致癌性，遺傳毒性、生殖毒性、基因毒性、組織吸收和器官排除、重復(fù)劑量毒性等?？蓞⒄找呙绮涣挤磻?yīng)的觀察方法觀察研究佐劑的不良反應(yīng)。

二、佐劑的臨床研究

臨床研究要能證明疫苗中佐劑的使用可增強(qiáng)針對抗原的免疫應(yīng)答，使免疫應(yīng)答達(dá)到預(yù)期的效果，同時不會明顯增加局部和全身不良反應(yīng)，以提高疫苗的安全性。應(yīng)保證佐劑的使用在增強(qiáng)免疫應(yīng)答中取得的潛在利益要超過可能帶來的風(fēng)險。

（一）佐劑免疫作用研究

早期的臨床研究主要在健康成人以及較少例數(shù)的特定目標(biāo)人群中進(jìn)行。如果疫苗計劃在全部人群或主要在嬰幼兒/兒童/老年人使用，則應(yīng)該在健康成人研究后，盡可能在一定數(shù)量的目標(biāo)人群中進(jìn)行觀察。確證性的臨床試驗則盡可能在目標(biāo)人群中進(jìn)行，如果年齡組跨度較大，應(yīng)事先分層或進(jìn)行一個以上臨床試驗。不論抗原是否已經(jīng)批準(zhǔn)上市，都應(yīng)包含單獨(dú)抗原與抗原加佐劑的對比研究，以證實加入佐劑的必要性。對于新佐劑和新抗原混合時，還應(yīng)采用預(yù)防同樣疾病的上市疫苗作為對照。免疫應(yīng)答的特征應(yīng)包括成品中抗原的單獨(dú)使用以及抗原/佐劑結(jié)合物接種時的免疫應(yīng)答的比較。應(yīng)對佐劑本身可能存在的潛在影響進(jìn)行綜合評價?？赡艿脑?，還應(yīng)對體液免疫和細(xì)胞免疫情況進(jìn)行評價。

（二）佐劑劑量研究

尋找合適的佐劑劑量以及佐劑與抗原的合適比例，以期取得免疫應(yīng)答和不良反應(yīng)之間權(quán)衡的最佳效果。對于新佐劑和已上市的抗原結(jié)合物，抗原劑量的選擇可以參考已上市同類產(chǎn)品的用量，重點(diǎn)考慮佐劑的使用劑量；而對于新佐劑和新抗原而言，既要考慮佐劑的劑量，同時應(yīng)考慮抗原的劑量。

劑量研究應(yīng)盡可能在疫苗的目標(biāo)人群中進(jìn)行。當(dāng)劑量探索研究未能選擇出合適的抗原/佐劑劑量時，就不得不用驗證試驗評價一種以上制品。

（三）觀察指標(biāo)及免疫測試方法的選擇

由于尚不清楚新佐劑在機(jī)體中對抗原免疫應(yīng)答的性質(zhì)產(chǎn)生何種影響，因此應(yīng)同時關(guān)注體液免疫和細(xì)胞免疫兩個方面的作用。在體液免疫方面，除了用ELISA檢測抗體外，如可能，還應(yīng)檢測中和抗體、殺噬菌體抗體或殺菌抗體，應(yīng)對免疫球蛋白的亞類進(jìn)行分析研究；在細(xì)胞免疫方面，應(yīng)檢測抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，包括Th1、Th2和T調(diào)節(jié)因子細(xì)胞和細(xì)胞因子；當(dāng)然最精確最有說服力的實驗是保護(hù)攻擊實驗。

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Nonclinical aspects of vaccine development

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