 嘻嘻嘻~你們的小闊愛來啦~ 一日不見如隔三秋，何況你的小闊愛還是一枚優(yōu)秀的技術(shù)支持~ 每次都帶來驚喜~嗷~ 本期帶來二代測序平臺對比介紹~ 前言 隨著人類基因組計劃的完成，測序技術(shù)的不斷發(fā)展成熟，二代測序[也稱下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS）] 越來越廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。NGS測序平臺經(jīng)歷了一系列收購合并，目前測序平臺主要來源于三家公司： Illumina、Life Technologies和華大基因。所謂“工欲善其事，必先利其器”，想要做好腫瘤基因測序，必須先要“pick”好二代測序平臺！本文將圍繞上述三大主要的平臺展開對比介紹，讓我們一起了解一下到底誰家測序平臺更適合您~ Illumina 1.1 基本原理 核心原理：邊合成邊測序（Sequencing By Synthesis，SBS）。主要流程：以雙端測序為例，主要包括DNA文庫構(gòu)建、流動槽（FlowCell）吸附、橋式PCR、SBS和數(shù)據(jù)分析過程。 1.2 主要測序儀 Illumina二代測序平臺的核心原理為SBS。目前常用的測序儀有如下3款。 圖1-1 Illumina MiSeqDx[1] MiSeqDx：是第一臺經(jīng)FDA批準(zhǔn)、適用于體外診斷（IVD）檢測的NGS平臺，并于2018年7月30日獲得NMPA認證。 適用范圍：專為臨床實驗室設(shè)計，適用于靶向基因測序、靶向基因表達譜、小型全基因組測序、16S宏基因組、長片段擴增子測序等。并廣泛應(yīng)用于癌癥、液體活檢等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1][2]。 儀器特點：MiSeqDx的操作簡便、體積小；靈活性強（不同通量的試劑可選，通量300MB~15GB）；可雙末端測序。但由于通量受限，MiSeqDx不適合用于全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）和全外顯子組測序（Whole Exome Sequencing，WES）[1][2]。 Illumina NextSeq 500 NextSeq 500：是Illumina在2014年發(fā)布的一款高通量臺式測序儀，其測序原理為改良的雙通道邊合成邊測序（雙通道SBS）技術(shù)。 適用范圍：靶向序列測序、大/小型全基因組測序、外顯子組測序、全轉(zhuǎn)錄組測序、基因表達譜、甲基化測序和16S宏基因組測序等。NextSeq 500同樣適合用于癌癥、液體活檢等科研實驗[1][2]。 儀器特點：NextSeq芯片通量更加靈活（16.25GB~120GB），可根據(jù)數(shù)據(jù)量需求，選擇合適通量的芯片。并且雙通道SBS技術(shù)減少測序所需時間[1][2]。 Illumina MiniSeq 圖1-3 Illumina MiniSeq[1] MiniSeq：是Illumina于2016年1月發(fā)布小型臺式測序儀，其體積比MiSeq小。該系統(tǒng)采用改良的雙通道邊合成邊測序技術(shù)原理。 適用范圍：靶向基因測序、靶向基因表達譜、小型基因全基因組測序、長片段擴增子測序、16S宏基因組測序等，可用于癌癥、液體活檢等科研實驗[1][2]。 儀器特點：運行時間短（7~24h）；操作簡便且通量靈活性高（1.65GB~7.5GB），對于通量小醫(yī)療單位，不需要累積大量樣本再上機；但MiniSeq不適合WGS和WES。 1.3 技術(shù)特點 技術(shù)優(yōu)點： 1. 通量靈活。 2. 簡單、快速、自動化，減少手工操作引入的誤差及污染。 3. 利用可逆熒光標(biāo)記終止子，可在DNA鏈延伸的過程中檢測單個堿基摻入，并減少摻入的誤差；同時SBS確保了高質(zhì)量數(shù)據(jù)。 4. SBS策略解決由于相同堿基聚合導(dǎo)致測序不準(zhǔn)確問題。 5. 錯誤率可低至0.1%，主要錯誤來源是堿基替換。 6. 可采用雙端測序技術(shù)。 技術(shù)缺點： 1. 測序讀長短（目前二代測序平臺面臨的共同難題）。 Life Technologies 2.1 基本原理 Ion Torrent測序同樣采用SBS策略，與Illumina不同的是，其應(yīng)用半導(dǎo)體測序技術(shù)，主要基于當(dāng)dNTP結(jié)合時將釋放氫離子（H+）引發(fā)pH變化來獲取堿基信息進行測序。主要步驟包括文庫構(gòu)建、乳液PCR、微珠富集、測序反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析。 2.2 主要測序儀 Life Technologies測序的核心技術(shù)是利用半導(dǎo)體技術(shù)將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為電信號，從而實現(xiàn)實時堿基判讀。Life Technologies于2013年被Thermo Fisher Scientific收購，目前常用的測序儀有如下幾款。 Ion Proton System 圖2-1 Ion Proton[3] Ion Proton：是Life Technologies于2012年在中國推出的新臺式基因測序儀。其核心技術(shù)為離子半導(dǎo)體測序技術(shù)。 適用范圍：人類基因組、外顯子組或轉(zhuǎn)錄組測序[2][3]。 儀器特點：與Illumina和華大基因的測序平臺不一樣，Life Technologies的平臺無光學(xué)系統(tǒng)，其使用半導(dǎo)體測序技術(shù)，因此運行速度快（2~4h）。 Ion S5和 Ion S5 XL 圖2-2 Ion S5和Ion S5 XL 系統(tǒng)[3] 注：A: Ion S5, B Ion S5 XL. Ion S5和Ion S5 XL：是Thermo Fisher于2015年發(fā)布的兩款適用于靶向測序的二代測序儀。Ion S5 XL與Ion S5相比，增加了本地運算，提升了數(shù)據(jù)分析速度。 適用范圍：適用于靶向RNA和DNA測序、微生物、轉(zhuǎn)錄組、外顯子組成?？捎糜诎┌Y、遺傳病等科研實驗領(lǐng)域[2][3]。 儀器特點：運行速度快（2.5~4h）。與Ion Proton的單端讀長（Single-end，SE）200bp相比，讀長更長，可達SE400bp。 2.3 技術(shù)特點 技術(shù)優(yōu)點： 1. 速度快，周期短。 2. 芯片通量靈活（0.3~0.5GB至10~15GB）。 技術(shù)缺點： 1. 只能做單端測序，單端測序最長讀長400bp。 2. 其技術(shù)原理導(dǎo)致測量單個堿基多次重復(fù)（如GGGGGG）可能出現(xiàn)誤差，這是限制該測序技術(shù)發(fā)展的主要原因[4]。 華大基因 3.1 基本原理 核心原理：邊連接邊測序（Sequencing By Ligation，SBL）。華大基因二代測序平臺（以BGISEQ-500為例）的五大關(guān)鍵技術(shù)流程：文庫構(gòu)建、DNA納米球（DNB）納米陣列組裝、聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)（combinatorial probe-anchor ligation，cPAL）、多重置換擴增的雙末端（Multiple Displacement Amplification-Pair End，MDA-PE）測序法和數(shù)據(jù)分析。 3.2 主要測序儀 華大基因的BGISEQ-1000雖然是國內(nèi)首個通過注冊的第二代基因檢測平臺，但BGISEQ-1000是一個大型平臺且難以小型化，對環(huán)境要求極苛刻，并不普遍適用于一般小型科研機構(gòu)或醫(yī)院。因此華大基因在2015和2016分別推出BGISEQ-500和BGISEQ-50，是目前常用的測序儀。 BGISEQ-500 圖3-1 BGISEQ-500 [5] BGISEQ-500：是華大基因于2015年推出的新型桌面化測序系統(tǒng)，以cPAL及改進的DNB為核心技術(shù)支撐。 適用范圍：靶向基因測序、腫瘤全外顯子組測序、轉(zhuǎn)錄組測序等[2][5]。 儀器特點：配備雙芯片平臺（單芯片65~260GB/run；雙芯片130~520GB/run）；但其最長讀長只有 雙端100bp（Paired-end，PE）。 BGISEQ-50 BGISEQ-50：華大基因于2016年推出的自主研發(fā)高通量臺式測序系統(tǒng)，其延用BGISEQ-500的核心技術(shù)原理。 適用范圍：無創(chuàng)產(chǎn)前篩查NIPS、植入前胚胎染色體篩查PGS、未知病原體快速檢測 PM-Seq、染色體異常檢測 ChromoSeq[5]。 儀器特點：與BGISEQ-500相比，BGISEQ-50更小巧、環(huán)境適應(yīng)性更好,平均數(shù)據(jù)量更小（5.6~8GB/run）,解決了BGISEQ-500在樣本量少時浪費芯片空間的問題。但BGISEQ-50讀長更短（SE50bp），不利于數(shù)據(jù)分析。 3.3 技術(shù)特點 技術(shù)優(yōu)點： DNB測序技術(shù)降低了試劑耗費同時增加數(shù)據(jù)產(chǎn)出，提高測序準(zhǔn)確性。具有如下優(yōu)勢： 1. 增加待測DNA拷貝，增強信號強度，從而提高準(zhǔn)確性。 2. 滾環(huán)擴增中擴增錯誤不會累積。 3. 芯片上每個活化位點只固定一個DNB，保證信號間不會相互干擾。 4. 陣列化測序芯片結(jié)合DNB測序技術(shù)使成像系統(tǒng)像素和測序芯片面積得到最大利用。 技術(shù)缺點： 1. 華大基因的二代測序平臺的讀長是三大平臺里面最短的，基因拼接可操作性差，這對數(shù)據(jù)分析影響大。 總結(jié) 如此看來，這三大二代測序平臺各有優(yōu)勢，先做一個簡單的對比總結(jié)（表4-1）：  首先是Illumina：目前Illumina已在第二代測序市場中占主導(dǎo)地位[6]。無可否認，由于其技術(shù)成熟，平臺穩(wěn)定多樣且平臺之間具有高度互補性與交叉性，使其在高通量測序市場上占很大優(yōu)勢。因此也越來越多研究實驗選擇使用Illumina的NGS平臺[7]。缺點則是平均測序成本相對其他兩個平臺更高點。 然后是Life Technologies的測序平臺，其最具特色的是它們的技術(shù)原理——半導(dǎo)體測序技術(shù)。Ion Torrent是首個無需光學(xué)傳感系統(tǒng)的NGS平臺[8]，其將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化電信號，即通過合成堿基時釋放出的H+實現(xiàn)堿基的實時判讀，提升了測序速度。不過其對連續(xù)堿基的檢測還不夠完善，且測序準(zhǔn)確率較Illumina還是有所不及。 最后介紹的是華大基因。數(shù)據(jù)量大、平均測序成本低是其優(yōu)勢，適合做大型全基因組測序。但是要考慮樣本量有限時，芯片數(shù)據(jù)量浪費的情況。除此以外，華大NGS平臺的讀長較短（BGISEQ-500最長讀長PE100bp；BGISEQ-50最長讀長SE50bp），基因拼接可操作性較差，這影響了后續(xù)數(shù)據(jù)分析。 如此分析下來，Illumina在二代測序市場中能一馬當(dāng)先就理所當(dāng)然了。但想要“pick”好適合自己的平臺最后還是要結(jié)合具體情況具體分析~ 參考文獻 |
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