介紹

細(xì)胞治療和基因治療產(chǎn)品所需的測(cè)試已在FDA的兩份指導(dǎo)文件中進(jìn)行了描述。第一篇“人類體細(xì)胞治療研究新藥申請(qǐng)（IND）的化學(xué)、制造和控制（CMC）信息的內(nèi)容和審查”為FDA審查人員提供了關(guān)于在研究性新藥(IND)申請(qǐng)的化學(xué)、制造和控制(CMC)部分中期望使用細(xì)胞治療產(chǎn)品進(jìn)行臨床試驗(yàn)的指南。第二篇“人類基因治療研究新藥應(yīng)用(IND)的化學(xué)、制造和控制(CMC)信息為基因治療產(chǎn)品提供了類似的信息。這些指南構(gòu)成了本章的基礎(chǔ)。

  微生物和外來(lái)病毒因子檢測(cè)

1.1 無(wú)菌

建議對(duì)細(xì)胞庫(kù)、中間體和最終產(chǎn)品進(jìn)行微生物檢測(cè)。FDA表示應(yīng)使用21 Code of Federal Regulations (CFR) 610.12 方法[5]。該方法在美國(guó)藥典 (USP) <71> [6]中有描述。如果使用替代方法，則應(yīng)確定其適用性，并且必須等于或大于推薦方法提供的保證。

兩種最流行的快速方法是來(lái)自 Becton Dickinson[7]的Bactec系統(tǒng)和來(lái)自bioMérieux[8]的BacT/ALERT系統(tǒng)。2008年，F(xiàn)DA最初發(fā)布了關(guān)于快速無(wú)菌檢測(cè)方法驗(yàn)證的指南，但該指南于2015年撤回[9]。我們的工廠已對(duì)Becton Dickinson Bactec快速無(wú)菌測(cè)試方法的使用進(jìn)行了內(nèi)部驗(yàn)證，但這尚未提交給 FDA（該機(jī)構(gòu)）。盡管如此，F(xiàn)DA還是允許我們使用這種方法對(duì)細(xì)胞治療產(chǎn)品進(jìn)行無(wú)菌測(cè)試。

但是，我們確實(shí)在無(wú)菌測(cè)試中對(duì)CFR方法進(jìn)行了修改。我們將需氧和厭氧Bactec培養(yǎng)物培養(yǎng)14天，將真菌培養(yǎng)物培養(yǎng)28天。我們確實(shí)有一些IND，F(xiàn)DA允許我們?cè)谂囵B(yǎng)7天后放行產(chǎn)品。各種方法的比較已經(jīng)發(fā)表[10, 11]。FDA現(xiàn)在鼓勵(lì)使用快速測(cè)試系統(tǒng)[4]。

如果在生產(chǎn)過程中使用了抗生素，則應(yīng)有文件證明在進(jìn)行無(wú)菌測(cè)試之前已將其去除。如果它們無(wú)法去除，則應(yīng)按照USP <71> [6]中的描述進(jìn)行抑菌/抑真菌試驗(yàn)。

還應(yīng)在制造過程中的關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行無(wú)菌測(cè)試。對(duì)于給藥前未經(jīng)處理的凍存產(chǎn)品，應(yīng)在凍存前進(jìn)行檢測(cè)。如果產(chǎn)品被解凍和處理，例如清洗，則應(yīng)重復(fù)無(wú)菌測(cè)試。這些應(yīng)包括在給藥前立即提供革蘭氏染色結(jié)果和14天培養(yǎng)，一旦獲得結(jié)果應(yīng)立即報(bào)告給接受者的醫(yī)生，并制定處理14天陽(yáng)性結(jié)果的計(jì)劃。

在其他情況下，如果在獲得培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果之前施用產(chǎn)品，建議在最終收獲前48-72小時(shí)或最后一次進(jìn)樣培養(yǎng)細(xì)胞后將樣品送去進(jìn)行無(wú)菌測(cè)試。這應(yīng)該與最終配方產(chǎn)品的革蘭氏染色和常規(guī)14天培養(yǎng)測(cè)試相結(jié)合[3]。

1.2 支原體

FDA將支原體感染的來(lái)源確定為制造和培養(yǎng)環(huán)境中使用的任何動(dòng)物血清，尤其是在使用開放系統(tǒng)的情況下[3]。他們建議在最有可能檢測(cè)到污染的制造階段進(jìn)行測(cè)試，例如，在混合培養(yǎng)物之后但在細(xì)胞洗滌之前。

應(yīng)對(duì)細(xì)胞和上清液進(jìn)行測(cè)試。如果沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行基于培養(yǎng)的測(cè)試[12]，他們建議使用基PCR或快速檢測(cè)分析。有幾種經(jīng)批準(zhǔn)的PCR檢測(cè)方法。這些包括來(lái)自Thermo Fisher的 MycoSEQ? [13]和來(lái)自Roche [14]的MycoTOOL?。

如果使用未經(jīng)批準(zhǔn)的方法，則應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證以表明該方法在靈敏度和特異性方面與培養(yǎng)技術(shù)相當(dāng)。PCR檢測(cè)的替代方案是來(lái)自Lonza[15]的MycoAlert?檢測(cè)系統(tǒng)。這是一種生化測(cè)試，它利用了在所有六種主要支原體細(xì)胞培養(yǎng)污染物中發(fā)現(xiàn)的支原體酶的活性。

測(cè)試樣品中的活支原體被裂解，酶與測(cè)試底物反應(yīng)，催化ADP轉(zhuǎn)化為ATP。然后通過熒光素酶將其轉(zhuǎn)換為光信號(hào)，使用光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。通過在添加底物之前和之后測(cè)量樣品中的ATP水平，可以獲得指示支原體存在或不存在的比率。由于該測(cè)試尚未獲得完整的監(jiān)管批準(zhǔn)，建議對(duì)培養(yǎng)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

最近，生物梅里埃宣布推出他們的 BIOFIRE?MYCOPLASMA 檢測(cè)[16]。如果最終產(chǎn)品的成分可能干擾支原體檢測(cè)，還應(yīng)進(jìn)行支原體檢測(cè)[17]。

2019年，F(xiàn)DA發(fā)布了一項(xiàng)擬議規(guī)則，以取消目前21 CFR 610.30要求的病毒收集細(xì)胞和由體外活細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的活和滅活病毒疫苗的控制液池中真菌血漿檢測(cè)的測(cè)試方法[18]。這表明該機(jī)構(gòu)在考慮其他測(cè)試方法時(shí)可能具有靈活性。

1.3 外來(lái)因子檢測(cè)

FDA建議咨詢他們的“用于生產(chǎn)生物制品的細(xì)胞系特征的考慮要點(diǎn)”[19]和國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(ICH)指南Q5A“源自人類細(xì)胞系的生物技術(shù)產(chǎn)品的病毒安全評(píng)估指南”和動(dòng)物來(lái)源”，以確定其他外來(lái)因子可能需要進(jìn)行哪些測(cè)試[20]。

一般而言，對(duì)于來(lái)自經(jīng)過供體資格測(cè)試的供體的自體或同種異體細(xì)胞系的細(xì)胞治療產(chǎn)品，通常不需要進(jìn)行病毒檢測(cè)[21]，除非這些產(chǎn)品用于衍生連續(xù)細(xì)胞系，例如，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。如果生產(chǎn)細(xì)胞系，如果該細(xì)胞系用于非常小的臨床試驗(yàn)，有時(shí)可能僅進(jìn)行體外外源病毒測(cè)試。然而，更常見的是，除了體外和體內(nèi)外源病毒檢測(cè)外，還必須通過PCR檢測(cè)該品系的一組特定病毒[3]。

鑒別

執(zhí)行身份測(cè)試以驗(yàn)證產(chǎn)品是否正確，并將其與工廠制造的其他產(chǎn)品區(qū)分開來(lái)。這可以使用各種測(cè)試來(lái)完成。最常用的是流式細(xì)胞術(shù)的免疫表型分析。在大多數(shù)情況下，最終產(chǎn)品的免疫表型應(yīng)符合特定CD標(biāo)記物表達(dá)或不表達(dá)的規(guī)范。

在早期臨床試驗(yàn)中，表達(dá)水平可能相對(duì)寬松，例如<2% CD19、>70% CD3，但隨著試驗(yàn)的進(jìn)展，預(yù)計(jì)表達(dá)水平會(huì)更嚴(yán)格。在分析中加入許多陽(yáng)性和陰性標(biāo)記是正常的，這些應(yīng)該由監(jiān)管機(jī)構(gòu)審查。免疫表型也用于確定最終產(chǎn)品中的相對(duì)細(xì)胞純度。這些檢測(cè)應(yīng)由經(jīng)認(rèn)可的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

另一種可用于確定產(chǎn)品身份的分析是基因多態(tài)性分型，例如血型，這可能包括在內(nèi)[3]，盡管這不是高度特異性的。相反，對(duì)于表達(dá)HLA 抗原的細(xì)胞來(lái)說，細(xì)胞供體和最終產(chǎn)物之間的HLA身份是更可取的。

純度

純度被定義為在最終產(chǎn)品中相對(duì)不含外來(lái)材料，無(wú)論該材料是否對(duì)預(yù)期接受者有害或?qū)Ξa(chǎn)品有害[22]。雜質(zhì)包括內(nèi)毒素、殘留蛋白質(zhì)或用于脈沖或刺激細(xì)胞的肽、制造過程中使用的試劑/成分，例如，細(xì)胞因子、抗體和血清，以及意外的細(xì)胞表型。

3.1 殘留污染物

應(yīng)檢測(cè)最終產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中使用的殘留蛋白質(zhì)和肽以及培養(yǎng)和純化過程中使用的試劑，例如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、抗體、珠子和血清。還應(yīng)測(cè)試最終產(chǎn)品的細(xì)胞碎片和其他免疫表型。IND[3]中必須描述要使用的檢測(cè)方法和產(chǎn)品放行的規(guī)范。

3.2 內(nèi)毒素

測(cè)試熱原性的傳統(tǒng)方法是兔熱原測(cè)試[23]。然而，這在很大程度上已被鱟變形細(xì)胞裂解物測(cè)試所取代。這反過來(lái)已使FDA批準(zhǔn)的設(shè)備自動(dòng)進(jìn)入快速檢測(cè)-Endosafe? nexgen-PTS?系統(tǒng)與FDA許可的 Endosafe? LAL墨盒[24]。通常批準(zhǔn)的規(guī)格為<5.0 EU/kg 體重/小時(shí)。對(duì)于所管理的產(chǎn)品。對(duì)于鞘內(nèi)給藥的產(chǎn)品，限值為0.2 EU/kg體重/小時(shí)[3]。Endosafe系統(tǒng)的使用提供了適用于所有產(chǎn)品的快速周轉(zhuǎn)時(shí)間。

效力

應(yīng)在臨床試驗(yàn)的所有階段對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行效價(jià)測(cè)定；然而，在第 3 階段開始時(shí)，測(cè)定應(yīng)包括測(cè)量適當(dāng)生物活性的體內(nèi)或體外測(cè)試。該檢測(cè)必須在產(chǎn)品許可之前進(jìn)行驗(yàn)證。如果無(wú)法開發(fā)定量生物測(cè)定，則可以使用定量物理測(cè)定，前提是它與定性生物測(cè)定結(jié)合并與之相關(guān) [3]。

對(duì)于早期試驗(yàn)，其中產(chǎn)品的體內(nèi)作用機(jī)制可能不清楚，使用定量可能效應(yīng)機(jī)制的試驗(yàn)是正常的，例如細(xì)胞因子釋放、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。這些應(yīng)該討論 在提交方案時(shí)與監(jiān)管機(jī)構(gòu)聯(lián)系。

其他檢測(cè)

5.1 細(xì)胞活力

應(yīng)該有一個(gè)特定的細(xì)胞活力釋放標(biāo)準(zhǔn)。FDA 通常要求基準(zhǔn)為 70% [3]。如果這無(wú)法實(shí)現(xiàn)，則應(yīng)證明死細(xì)胞不會(huì)對(duì)產(chǎn)品的安全給藥或其治療效果產(chǎn)生不利影響。許多測(cè)定可用于確定細(xì)胞活力。常用的是染料排除試驗(yàn)，例如臺(tái)盼藍(lán)排除法[25]；然而，這取決于觀察者的可變性，并不總能檢測(cè)到隨后可能發(fā)生的亞致死損傷。使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的分析，例如，用7氨基放線菌素 D (7-AAD) 染色，可提供更具重現(xiàn)性的生存力評(píng)估 [26]。也可以通過膜聯(lián)蛋白染色來(lái)測(cè)量細(xì)胞凋亡[27]?，F(xiàn)在可用于執(zhí)行自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力測(cè)量的設(shè)備，例如來(lái)自Nexcelom [28]的Cellometer Auto 1000 Bright Field Cell Counter 和來(lái)自Chemometec [29] 的 NucleoCounter? NC-202?。這些應(yīng)在使用前進(jìn)行驗(yàn)證。

FDA通常根據(jù)冷凍保存時(shí)的活力來(lái)確定活力釋放標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)該確認(rèn)，通過驗(yàn)證用于冷凍的方法，解凍后可以滿足該標(biāo)準(zhǔn)。

5.2 細(xì)胞劑量

應(yīng)指定要施用的最小活細(xì)胞和功能細(xì)胞數(shù)。建議將根據(jù)臨床前實(shí)驗(yàn)確定的最大劑量告知 FDA。

產(chǎn)品穩(wěn)定性

必須在臨床試驗(yàn)的早期階段評(píng)估產(chǎn)品的穩(wěn)定性，以確定它在整個(gè)試驗(yàn)期間都是穩(wěn)定的。ICH已發(fā)布指南以幫助這些研究：“ICH指南Q1E'生物技術(shù)/生物制品的穩(wěn)定性測(cè)試’[30]和指南Q1A(R2)'新藥和產(chǎn)品的穩(wěn)定性測(cè)試’”[31]。

FDA要求在IND的所有階段進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試。測(cè)試方案應(yīng)包括無(wú)菌、特性、純度、質(zhì)量和效力的測(cè)量[3]。必須描述測(cè)試方法以及采樣時(shí)間點(diǎn)（包括時(shí)間零點(diǎn)）、測(cè)試溫度和任何其他適當(dāng)?shù)男畔?。?yīng)在零時(shí)間、穩(wěn)定性研究結(jié)束時(shí)和一個(gè)中間時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行無(wú)菌測(cè)試[3]。

討論

質(zhì)量控制部門通過進(jìn)行中間和最終產(chǎn)品測(cè)試，在治療產(chǎn)品的發(fā)布中發(fā)揮著重要作用。他們提供的信息還可以幫助識(shí)別制造程序的改進(jìn)并識(shí)別操作過程中的弱點(diǎn)。因此，它們?cè)贕MP操作中起著至關(guān)重要的作用。

本章代表了一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，始終鼓勵(lì)研究人員聯(lián)系適當(dāng)?shù)谋O(jiān)管機(jī)構(gòu)，以確定用于臨床使用的細(xì)胞療法和病毒載體的釋放的現(xiàn)行法規(guī)。

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