擴增子測序是一種高靶向性方法（對特定長度的PCR產(chǎn)物或者捕獲的片段進行測序），用于分析特定基因組區(qū)域中的基因變異。PCR產(chǎn)品（擴增子）的超深度測序可以有效地識別變異并對其進行特征分析。總體思路是靶向地捕獲目標區(qū)域，然后進行新一代測序(NGS)，分析測序結(jié)果，得到相應(yīng)信息。

根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系，將Hiseq測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接 (Merge)成一條序列Tags，同時對Reads的質(zhì)量和Merge的效果進行質(zhì)控過濾。主要有如下3個步驟：

1) PE reads拼接：使用 FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對每個樣品的 reads 進行拼接，得到的拼接序列即原始 Tags 數(shù)據(jù)(Raw Tags)；

2) Tags過濾：使用 Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的 Raw Tags進行過濾，得到高質(zhì)量的Tags 數(shù)據(jù)(Clean Tags)；

3) 去除嵌合體：使用 UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù) (Effective Tags)。

OTU即分類操作單元，是在系統(tǒng)發(fā)生學研究或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元（品系，種，屬，分組等）設(shè)置的同一標志。

使用QIIME（version 1.8.0）軟件中的 UCLUST對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU，并基于Silva（細菌）和UNITE（真菌）分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋。

圖1.各樣品OTU個數(shù)分布圖

將OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫進行比對可得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，進而在各水平（phylum，class，order，family，genus，species）統(tǒng)計各樣品群落組成，利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語言工具繪制成樣品各分類學水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。

圖2.物種分布圖              圖3.物種豐度聚類熱圖

用QIIME軟件挑選出屬分類學水平上豐度最高的OTU的序列作為代表序列，進行多重序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，然后通過Python語言工具繪制圖形。

圖4.物種系統(tǒng)進化樹

使用KRONA對物種注釋結(jié)果進行可視化展示，展示結(jié)果中，圓圈從內(nèi)到外依次代表不同的分類級別，扇形的大小代表不同OTU注釋結(jié)果的相對比例。

圖5.KRONA示意圖

Alpha多樣性（Alpha diversity）反映的是單個樣品物種豐度（richness）及物種多樣性（diversity），有多種衡量指標：Chao1、Ace、Shannon、Simpson。Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度（Community evenness）的影響。

使用Mothur （version v.1.30） 軟件，對樣品Alpha多樣性指數(shù)進行評估。一般為比較樣品間的多樣性指數(shù)，分析時會將樣品所含序列數(shù)進行標準化。

稀釋性曲線(Rarefaction Curve)從樣本中隨機抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計這些序列所代表的物種數(shù)目，并以序列數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建曲線，用于驗證測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。

圖6.稀釋性曲線圖

利用 Mothur 軟件和R語言工具依據(jù)各樣品的測序量在不同測序深度時的Shannon指數(shù)（反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)）繪制Shannon多樣性指數(shù)稀釋曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。Shannon index越大則OTU種類越多，物種越豐富，表明樣品中已涵蓋絕大多數(shù)的微生物物種信息。

圖7.Shannon Index曲線

使用QIIME軟件進行 Beta 多樣性(Beta diversity)分析，比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。Beta多樣性分析主要采用binary jaccard、bray curtis、weighted unifrac(限細菌)、 unweighted unifrac (限細菌)等4種算法計算樣品間的距離從而獲得樣本間的β值?；谶@4種距離矩陣展開的Beta多樣性分析，主要有以下幾點。

1）PCA與PCoA分析：通過一系列的特征值和特征向量進行排序，選擇主要的前幾位特征值，采取降維的思想，找到距離矩陣中最主要的坐標，從而觀察個體或群體間的差異。

圖8.PCA分析圖

2）NMDS分析：將對象間的相似性或相異性數(shù)據(jù)看成點間距離的單調(diào)函數(shù)，在保持原始數(shù)據(jù)次序關(guān)系的基礎(chǔ)上，用新的相同次序的數(shù)據(jù)列替換原始數(shù)據(jù)進行度量型多維尺度分析，用于比對樣本組之間的差異。

圖9.NMDS分析圖

3）UPGMA分析：基于各樣品序列間的進化信息的差異來計算樣品間的差異，可以反映樣品在進化樹中是否有顯著的微生物群落差異。

4）組間物種差異熱圖：基于OTU-Table和上述4種距離矩陣進行物種聚類，從聚類中可以了解樣品之間的相似性以及各分類水平上的群落構(gòu)成相似性。 

圖10.UPGMA聚類樹

組間差異顯著性分析主要用于發(fā)現(xiàn)不同組間具有統(tǒng)計學差異的Biomarker。

使用PICRUSt軟件通過比對16S測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異。

首先需要對生成的OTU-table進行標準化（不同的種屬菌包含的16S拷貝數(shù)不相同）；然后，通過每個OTU對應(yīng)的greengene id，即可獲得OTU對應(yīng)的KEGG和COG家族信息，從而計算該KEGG和COG的豐度并從KEGG數(shù)據(jù)庫的信息中獲得Pathway、EC信息、OTU豐度計算各功能類別的豐度。

圖11.組間KEGG代謝途徑差異分析圖

圖12.COG功能分類統(tǒng)計圖