解決內外源病毒污染，你必須了解的清除滅活病毒驗證及解決方案

劉得光3p6n6zqq 2021-07-20

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生物制品生產(chǎn)原輔材料通常為生物源的（如微生物、細胞、動物或人源的組織和體液等），具有潛在內外源病毒污染的風險。因此國內外的相關法規(guī)要求生物制品在生產(chǎn)過程中應包含至少一步或者多步具備滅活/清除病毒能力的工藝步驟，而且要對這些步驟的病毒滅活/清除能力進行驗證。理想情況下，病毒被添加到具有代表性的生產(chǎn)樣品中（該樣品與生產(chǎn)過程樣品有相同的濃度、緩沖體系和生產(chǎn)歷史等），以評估產(chǎn)品生產(chǎn)工藝清除\滅活已知和未知病毒的能力，法規(guī)要求至少達到4Lg的LRV值才是有效的清除滅活步驟。

污染來源及模式病毒

細胞系被認為是病毒污染的關鍵來源，細胞庫（主細胞庫[MCB]和工作細胞庫[WCB]）在用于臨床生產(chǎn)之前需進行了廣泛而細致的檢測，以證明沒有病毒污染，ICH Q5A詳細介紹了細胞系鑒定檢測指南。

清除/滅活病毒驗證的目的是評估生產(chǎn)工藝清除/滅活已知病毒的能力，并通過表征其清除/滅活 “模型”病毒的能力來估計。病毒清除/滅活驗證選擇模型病毒的因素包括病毒滴度、病毒滴度檢測方法以及病毒可能對研究人員造成的健康危害。

通常用于病毒清除/滅活驗證的小鼠或倉鼠細胞系小鼠逆轉錄病毒模型是異嗜性小鼠白血病病毒（X-MuLV）和鼠細小病毒（MMV），MMV是一種小型的非包膜病毒，由于低pH條件不能使其失活，因此通常更難清除。

在新藥IND申請階段，需要對至少兩種模型病毒進行病毒清除/滅活驗證研究，通常選擇一種模式逆轉錄病毒（X-MuLV）和一種細小病毒（MMV）。在BLA申請階段，通常使用至少3-5種模型病毒進行病毒清除/滅活研究。下表為一組在新藥Phase III階段鼠細胞系衍生產(chǎn)品病毒清除/滅活研究中模型病毒。

清除/滅活病毒工藝

過濾

生物制品生產(chǎn)過程中，過濾是一個關鍵的除病毒步驟，雖然過濾已被證明對較大的病毒顆粒有可靠的去除效果，但去除尺寸很小的病毒（如細小病毒）的效果較差。Miesegaes等人總結了除病毒過濾的數(shù)據(jù)、工藝操作范圍和減壓對除病毒過濾的影響。在除病毒過濾加標研究中，病毒原液的質量對病毒去除過濾器的性能有重大影響。高純度的病毒儲備溶液可確保病毒過濾器不會因來自加標病毒的微粒而堵塞，并導致過濾膜蛋白質載量顯著提升。

眾所周知，低pH條件可以成功地滅活包膜病毒，這與單克隆抗體（mAb）下游純化工藝非常兼容，Protein A捕獲柱通常在低pH下洗脫，洗脫之后是低pH孵育步驟，以滅活病毒。

病毒滅活步驟通常在pH3.0和4.0之間進行，已經(jīng)證明，穩(wěn)定的病毒滅活需要3.8或更低的pH值。在pH值為3.8或以下時，病毒滅活非常迅速，通常在10-15分鐘內完成。對于低pH值滅活需建立滅活動力學曲線。

有機溶劑/表面活性劑

對于一些不能耐受低pH的產(chǎn)品，通常使用有機溶劑/表面活性劑（S/D）作為滅活包膜逆轉錄病毒的方法。S/D是處理血液制品的主要方法之一，也常用于滅活重組蛋白產(chǎn)品中的包膜病毒，特別是當產(chǎn)品不能耐受低pH。常用的滅活條件是0.3% TNBP和1%吐溫-80，24℃處理至少6h；0.3%TNBP和1%Triton X-100，24℃處理至少4小時。S/D處理前應先用1um濾器除去蛋白溶液中可能存在的顆粒（顆?？赡懿啬洳《緩亩绊懖《緶缁钚Ч?。加入S/D后應確保是均一的混合物。在滅活病毒全過程中應將溫度控制在規(guī)定的范圍內。

色譜層析

常用的除病毒色譜層析方法有親和層析（如Protein A）和離子交換層析。

Protein A親和層析為單克隆抗體和Fc融合蛋白提供了高度的選擇性，并被廣泛用于它們的純化。Protein A親和層析通?？梢赃_到4-5個LRV的逆轉錄病毒清除率；

陰離子交換色譜法是一種強大的逆轉錄病毒清除方法。在適當?shù)臈l件下，該步驟還可以提供>4 LRV。因此，這是一個首選的病毒清除步驟，特別是對于單抗這種典型的堿性蛋白質，可以通過陰離子層析純化及去除病毒。陽離子交換和疏水層析已被證明具有相對較低的LRV。根據(jù)工藝條件，通常可獲得1-3個對數(shù)的LRV。

其他

A．巴氏消毒法：對于有一定熱穩(wěn)定性的產(chǎn)品，可采用巴氏消毒法，巴氏消毒法可快殺滅速偽狂犬病病毒(PRV)，Sindbis病毒和HIV-1等病毒；經(jīng)實踐證明白蛋白的巴氏消毒法對HIV和肝炎病毒是安全的，其病毒滅活條件已經(jīng)很完善。

B．干熱法：80℃加熱72h，可以滅活HBV、HCV、HIV及AV等病毒，但應考慮制品的水分含量、制劑組成（如糖、蛋白、鹽分等）對病毒滅活效果的影響。病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗證一次。

清除/滅活毒方案設計

?除/滅病毒驗證研究應符合GLP的要求；

?研究影響去除/滅活病毒效果的參數(shù)允許變化的幅度；

?研究病毒滅活動力學，包括病毒滅活速率和滅活曲線；

?指示病毒滴度應盡可能高（病毒滴度應≥10^6/ml）;

如可能，驗證過程中每步取出的樣品應盡快直接檢測病毒滴度，不做進一步處理（如超離心、透析或保存等），如樣品必須做進一步處理，或不同時間取出的樣品要在同一時間內進行測定，應考慮這些處理對病毒滴度檢測結果的影響。

病毒滴度檢測方法

常用的病毒滴度檢測方法包括蝕斑法、TCID₅₀及Q-PCR法等方法。

蝕斑法和TCID₅₀法適用于感染并產(chǎn)生致病變效應的病毒的滴度測定，多數(shù)病毒感染體外培養(yǎng)的細胞后，常引起細胞形態(tài)學改變，如細胞團縮、裂解和細胞腫大等，這種改變稱為病毒致病變效應(cytopathic effect，CPE)，可以直接通過顯微鏡觀察，亦可通過染色識別和判斷。

熒光定量PCR（qPCR）可以將DNA序列的一段特定區(qū)域進行數(shù)量級擴增，因此是一種極其靈敏的檢測方法，廣泛應用于病毒的定性定量分析。該方法具有快速、特異、靈敏等、穩(wěn)定性好（≤15%）優(yōu)點。

解決方案

浙江恒馭生物科技有限公司（簡稱：恒馭生物）是一家由頂尖科研團隊創(chuàng)立，致力于為全球創(chuàng)新藥企提供生物檢測及相關工藝驗證、開發(fā)服務及產(chǎn)品的綜合供應商。

恒馭生物依托國內多地的BSL-2級實驗平臺、符合ISO9001、CNAS及GLP要求下的質量體系，為客戶藥物開發(fā)及上市生產(chǎn)階段提供有保障的生物安全性檢測服務，現(xiàn)階段已覆蓋病毒清除滅活工藝研究、細胞株/庫檢定、原材料檢測服務。

在病毒清除/滅活試驗平臺方面，恒馭生物擁有P2認證實驗室平臺、HyPure系列高滴度高純度病毒；在清除/滅活病毒驗證方法方面，恒馭生物可根據(jù)客戶需要對全部法規(guī)接受的主要方法進行去病毒工藝驗證，覆蓋生物制品（血液制品、真核細胞表達產(chǎn)品，如抗體、重組蛋白）、生化藥品（動物來源）及II、III類醫(yī)療器械產(chǎn)品。

在模式病毒方面，藥典示例常用指示病毒全覆蓋，并具備完善的細胞庫檢測服務（包括支原體、內外源病毒因子、致瘤性、成瘤性及染色體檢測），在病毒滴度檢測方法方面，建立了齊全的（如TCID₅₀、qPCR等）病毒滴度定量檢測方法。

國產(chǎn)新藥研發(fā)晝夜兼程，對于藥品“質量及安全”的研究與關注，是永恒的使命。基于此，由恒馭生物聯(lián)合佰傲谷BioValley舉辦的“GO H-Quality生物制藥安全及質量守護者”高端閉門系列沙龍活動之蘇州站將于2021年7月31日在蘇州金雞湖凱賓斯基大酒店舉辦。本次活動特邀多位行業(yè)大咖齊聚一堂，通過輕松開放的氛圍，致力于打造一個深刻精致、深度交流的平臺，共同助力推動中國生物醫(yī)藥質量安全的發(fā)展。誠邀您蒞臨本次盛會！

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活動流程安排

12:30-13:00 嘉賓簽到

13:00-13:05 開場介紹

13:05-13:40

主題：實現(xiàn)高效病毒清除的下游工藝開發(fā)控制策略

嘉賓：汪才坤 康日百奧下游研發(fā)負責人

13:40-14:20

主題：生物蛋白藥的表征

嘉賓：史力怡道生物董事長

14:20-14:50 茶歇

14:50-15:30

主題：生物制品生產(chǎn)中病毒清除驗證策略

嘉賓：朱向瑩 恒馭生物 CEO

15:30-16:10

主題：臨床研究質量管理體系簡介

嘉賓：蔣燕敏 和鉑醫(yī)藥質量部負責人

16:10-17:00 圓桌討論

﹡中國規(guī)模和創(chuàng)新速度對全球生物制藥價值鏈的影響

﹡國外內生物藥在 R&D、藥品質量和人才培養(yǎng)的差距和展望

﹡回首制藥生涯，走過的“坎”和“幸”

主持人：朱向瑩 恒馭生物 CEO

討論嘉賓：

史力 怡道生物董事長

秦剛 啟德醫(yī)藥董事長（TBD）

蔣燕敏 和鉑醫(yī)藥質量部負責人

郭樹華 普樂康醫(yī)藥董事長

17:00-17:30

全體與會嘉賓合影

17:30

當日活動結束~

參考文獻

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