細(xì)胞遷移的重要性

細(xì)胞遷移(cell migration)：也稱為細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞爬行或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，是指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。

它參與到很多生理和病理的活動(dòng)中，如下：

1. 免疫：如淋巴細(xì)胞的定向遷移是其分化成熟和發(fā)揮功能的關(guān)鍵之一；

2. 炎癥：炎癥反應(yīng)最重要的功能是將白細(xì)胞送到炎癥灶，白細(xì)胞遷移到炎癥部位并發(fā)揮其吞噬和組織損傷作用；

3. 腫瘤轉(zhuǎn)移：腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤惡化后最常見的活動(dòng)，如侵入淋巴管、血管后隨脈管系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；

4. 損傷修復(fù)：當(dāng)機(jī)體發(fā)生損傷時(shí)，免疫細(xì)胞和血小板會(huì)遷移到損傷部位，參與消炎和凝血；

5. 胚胎發(fā)育：胚胎期不同類型祖細(xì)胞遷移至特異靶位以保證各組織、器官的正常發(fā)育。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是目前測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的最常用也是最簡(jiǎn)單的方法，基本原理是：在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口”，邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕/傷口”愈合。因其類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實(shí)驗(yàn)（Wound-Healing Assay），廣泛用于可以觀察藥物、基因等外源因素對(duì)細(xì)胞遷移和修復(fù)的影響。

原理：如下圖所示：

細(xì)胞遷移動(dòng)態(tài)圖（來自網(wǎng)絡(luò)）

實(shí)驗(yàn)過程

在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后再繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間（可有不同時(shí)間點(diǎn)），取出細(xì)胞培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察周邊細(xì)胞是否遷至中央劃痕區(qū)，并拍照。

具體實(shí)驗(yàn)步驟

1. 培養(yǎng)板劃線標(biāo)記

用marker筆在6孔板背后畫橫線（用直尺比著），每孔至少穿過5條線，每條線均勻且平行。

6孔板背后劃線圖

2. 細(xì)胞鋪板

在孔內(nèi)接種約5-10*10⁵個(gè)細(xì)胞（可根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)快慢調(diào)整接種數(shù)量），原則為過夜后細(xì)胞能夠長(zhǎng)滿，切記一定要鋪勻（細(xì)胞鋪板均勻技巧可參考往期內(nèi)容）。

3. 細(xì)胞劃線

第二天用20uL槍頭（滅菌）或牙簽，垂直孔板背后的黑線劃痕，使劃痕與標(biāo)記線相交。

細(xì)胞劃線姿勢(shì)圖（右圖來自網(wǎng)絡(luò)）

Tips：減少劃痕距離的誤差辦法：

• 不同孔之間最好使用同一只槍頭或牙簽；

• 槍頭要垂直，不能傾斜，劃痕時(shí)可比著直尺；

• 最好保持力度一致，盡量一次性劃完。

4. 洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞

劃線完成后，使用無菌PBS洗細(xì)胞2-3次，去除劃下的細(xì)胞，使留下的間隙肉眼即清晰可見，然后更換新鮮無血清或低血清（<2%）的培養(yǎng)基。

Tips：

• 在用PBS緩沖液沖洗時(shí)，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞；

• 為了避免細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)受到影響，盡量不要用吸泵，可用移液槍緩慢吸走。

5. 細(xì)胞培養(yǎng)與觀察

將細(xì)胞放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)，如0，6，12，24小時(shí)后取出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察并拍照。

6. 數(shù)據(jù)分析

舉例：如細(xì)胞劃痕常用于研究藥物或者基因等對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。通過比較Control組和CE(10ug/ml)組，發(fā)現(xiàn)CE顯著抑制了小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10-Nex2的遷移能力。 

B16F10-Nex2細(xì)胞遷移圖[1]

數(shù)據(jù)處理：一般通過對(duì)初始劃線（0h）和后期觀察點(diǎn)的劃痕的面積或距離對(duì)比來判斷。

面積：如下為ImageJ計(jì)算劃痕面積：

上圖左：黃色包圍的面積即為測(cè)量的劃痕區(qū)；

上圖中間：劃痕區(qū)示意圖

上圖右：紅色框內(nèi)的數(shù)值即為測(cè)得的劃痕區(qū)面積值

如下圖為肝癌細(xì)胞系SK-hep1的遷移過程及劃痕面積統(tǒng)計(jì)圖[2]：

統(tǒng)計(jì)距離：使用 Image J 軟件，劃取6至8條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。此外，還可以使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕區(qū)域的像素來定量比較細(xì)胞遷移的速度。

如下圖為B16F10細(xì)胞的遷移過程[3]，并統(tǒng)計(jì)遷移距離，計(jì)算出遷移速度：

常見問題解答

• 劃痕實(shí)驗(yàn)為什么一般選擇6孔板？

因?yàn)?孔板大小適中，可保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，便于觀察；當(dāng)然若是需要高通量初篩時(shí)，也可以用12或者24孔板。

• 為啥細(xì)胞的接種密度原則為：過夜為100%融合？

若過夜后細(xì)胞未100%融合，雖可以適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，但因細(xì)胞密度已經(jīng)很大，所以細(xì)胞狀態(tài)會(huì)逐漸變差，后續(xù)細(xì)胞可能不遷移而是凋亡。

• 如何降低細(xì)胞增殖對(duì)遷移造成的假陽性結(jié)果？

① 使用無血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響； ② 一般認(rèn)為24h為細(xì)胞的一個(gè)周期，在選取合適的時(shí)間點(diǎn)（6，12，24h）檢測(cè)劃痕寬度時(shí)，最好不要超過細(xì)胞一個(gè)周期的時(shí)間；③  如果要單純考慮細(xì)胞遷移，可以先用絲裂霉素（1μg/ml）處理1h，抑制細(xì)胞的分裂。

• 如何確保拍照的觀察點(diǎn)？

按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點(diǎn)，劃痕一次與5條定位線相交，就有10個(gè)可固定監(jiān)測(cè)點(diǎn)，以解決了前后觀察時(shí)位置不固定的問題。

• 細(xì)胞不遷移怎么辦？

避開細(xì)胞狀態(tài)的影響，需要考慮細(xì)胞自身的遷移能力，并非所有細(xì)胞都適合劃痕實(shí)驗(yàn)，以乳腺癌為例，乳腺癌細(xì)胞MCF-7幾乎很難遷移，而MDA-MB-231具有很強(qiáng)遷移性。

• 為什么有的文章用細(xì)胞計(jì)數(shù)分析？

因?yàn)橛械募?xì)胞遷移輪廓比較清晰，并且遷移數(shù)量不多，我們可以選擇細(xì)胞計(jì)數(shù)（如下圖的HUVEC）；但如果細(xì)胞數(shù)比較多，連片生長(zhǎng)，那么統(tǒng)計(jì)面積比細(xì)胞計(jì)數(shù)的方式更簡(jiǎn)便且客觀（如上圖的SK-hep1）。

• 細(xì)胞劃痕法有哪些不足？

① 適用的細(xì)胞類型范圍小，一是需要遷移強(qiáng)的細(xì)胞，而且對(duì)無血清的環(huán)境有較強(qiáng)的忍受力（至少24h）然而很多腫瘤細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)下，12h細(xì)胞凋亡就超過50%，因此細(xì)胞劃痕法對(duì)部分腫瘤細(xì)胞并不適用。② 自身操作的實(shí)驗(yàn)誤差，如劃痕距離不一致等。

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤研究的重要方向，因此轉(zhuǎn)移相關(guān)研究方法十分重要。本期我們介紹了體外細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基本實(shí)驗(yàn)步驟及需要注意的細(xì)節(jié)，希望大家可以獲益，拍出漂亮的細(xì)胞圖片來。

參考文獻(xiàn)

1.Figueiredo, C.R., et al. Antitumor activity of kielmeyera coriacea leaf constituents in experimental melanoma, tested in vitro and in vivo in syngeneic mice. Advanced pharmaceutical bulletin 4, 429-436 (2014).   

2.Gao, W., Kim, H. & Ho, M. Human Monoclonal Antibody Targeting the Heparan Sulfate Chains of Glypican-3 Inhibits HGF-Mediated Migration and Motility of Hepatocellular Carcinoma Cells. PloS one 10, e0137664 (2015).

3.Justus, C.R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M. & Yang, L.V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of visualized experiments : JoVE (2014)

4.Jonkman, J.E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell adhesion & migration 8, 440-451 (2014).